Coronavirus
Structural Task Force

Volle Kanne nachgefragt: Die vier Postulate des Herrn Koch

Nach dem Fernsehauftritt heute früh bei ZDF "Volle Kanne" erreichten uns viele Email mit Fragen (und auch ein bisschen Fanpost). Eine dieser Fragen war die Folgende:

Sind sie sicher, dass das Virus nach den Koch'schen Postulate isoliert und unter einen Elektronenmikroskop dargestellt werden kann? Könnten sie mir ein Link von dieser sensationellen Studie schicken?

Der Kontext dieser Anfrage ist, dass viele Gegner der Corona-Maßnahmen behaupten, das Virus würde gar nicht existieren, bzw. hätte anhand der Koch'schen Postulate als Erreger von COVID-19 nicht nachgewiesen werden können.

Info: Die Koch'schen Postulate
Der Nachweis eines Krankheitserregers als Ursache einer Erkrankung wurde von Robert Koch und seinem Doktorvater Henle in drei (bzw. vier) Postulaten zusammengefasst:
1. Ein Krankheitserreger muss sich in allen Fällen bei einer bestimmten Krankheit nachweisen lassen, wohingegen er beim Gesunden immer fehlen muss.
2. Der Krankheitserreger muss sich auf Nährböden oder in geeigneter Zellkultur züchten lassen und zwar in Form von Reinkultur.
3. Gesunde Tiere müssen nach der Inokulierung des Erregers die gleiche Krankheit entwickeln.
4. Ausserdem muss die Re-Isolierung des Erregers aus den experimentell infizierten Tieren gelingen.

Diese Frage wurde uns in den vergangenen Monaten immer wieder gestellt: Existiert das Virus wirklich? Kann man beweisen, dass es wirklich Zellen befällt und so der Auslöser für COVID-19 ist?
Hier als Antwort zwei sehr hübsche (falls man das so sagen darf) Bilder aus der Fachliteratur, und in der Tat zwei sensationelle Studien:

Lungenepitelzellen infiziert mit Corona. EM-aufnahme.
Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme von mit SARS-CoV-2 infizierten Lungen-Epithelzellen. Die Zellen wurden mit einem Virus-Isolat infiziert und in Reinkultur gezüchtet. Die kugelförmigen Viren sitzen auf "Borsten" - so genannten Cilien, die für gewöhnlich Staub etc. aus der Lunge abtransportieren. Das spinnwebartige Gefelcht im linken Bild ist Schleim. Bild von C. Ehre, Baric and Boucher Laboratories, University of North Carolina School of Medicine. DOI: 10.1056/NEJMicm2023328
Elektronentomogramm des Virus SARS-CoV-2 und 3D-Rekonstruktion
In diesem EM-Tomographie-Experiment in Heidelberg wurde anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen (wie a) sogar eine 3D-Rekonstruktionen des Virus gemacht (b), welcher in VeroE-Zellen kultiviert wurde. Das Virus-Isolat stammt von einem deutschen COVID-19 Patienten. Bild von Klein et al., Nature 2020 (https://doi.org/10.1038/s41467-020-19619-7).

Elektronenmikroskopische Aufnahmen sowohl aus Lungengewebe, als auch isoliert in aus Kultur, gibt es ungefähr seit März/April 2020.

Noch ein Wort zu den Koch'schen Postulaten

Grundsätzlich sind die Koch'schen Postulate zum Nachweis einer Infektion etwas überholt. Sie stammen aus einer Zeit, in der Wissenschaftler nicht alle Krankheitserreger sichtbar machen konnten, und vorallem auch das Infektionsgeschehen nicht in der Zelle beobachten konnten. (Eine Isolation ist aber immernoch für uns notwendig, zum Beispiel bei der Sequenzierung oder auch, um das Krankheitsgeschehen an der Zelle gut beobachten zu können.) Koch selber widerlegte das dritte Postulat zum Teil selbst - nicht jeder, der Krankheitserreger trägt, muss auch erkranken. Das vielleicht bekannteste Beispiel einer asymptomatischen Trägerin ist "Typhoid Mary". Die Postulate sind darüberhinaus in einer Zeit entstanden, in der man Viren noch nicht kannte - diese lassen sich nur mit Wirtszellen zusammen züchten, da sie diese brauchen, um sich zu vermehren. (Aus diesem Grund sehen viele Wissenschaftler Viren auch nicht als Lebewesen an, weil sie sich nicht allein fortpflanzen können.)

Aber es könnten doch auch Exosomen sein...

Exosomen sind recht kleine Bläschen, die Zellen an ihre Umgebung abgeben, um zum Beispiel Proteine oder Erbgut loszuwerden oder woandershin zu transportieren. Ein Psychiater namens Kaufmann aus den USA hat kürzlich die Theorie aufgestellt, dass Coronaviren, wie die oben abgebildeten, Exosomen sind - und es dementsprechend keine Übertragung von Mensch zu Mensch gibt, weswegen Schutzmaßnahmen unnötig seien.

Tatsächlich sind Exosomen und Viren sich ähnlich: Beide entstehen aus Zellen, tragen Erbmaterial von Zelle zu Zelle und können Proteine enthalten. Allerdings sind Viren in der Lage, Zellen dazu zu bringen, mehr von sich zu produzieren. Sie machen immer und immer wieder gleich aufgebaute Kopien von sich selbst, und das hat oft den Tod der Wirtszelle bzw. des Wirtes zur Folge. Exosomen hingegen können sich nicht kopieren. Sie senden höchstens Signale an andere Zellen, und gehen danach in der neuen Zelle auf. Da in Studien wie den beiden oben genannten klar gezeigt wurde, dass das Coronavirus als Isolat Zellen befällt, sich dort vermehrt und dann in der Lage ist, weitere Zellen zu befallen, handelt es sich um einen Virus. Dementsprechend sind die Schutzmaßnahmen, unter denen wir gerade alle leiden, leider nötig.

___

Titelbild: Kolorierte Rastertunnelaufnahme vom NIAID Integrated Research Facility, Fort Detrick, Maryland.

Das SARS-CoV-2 Virus bringt riesige Einschränkungen für uns und unser Leben mit sich. Im krassen Kontrast dazu steht, wie winzig das Virus tatsächlich ist. Diese verschwinden geringe Größe des Virus ist auch das, was unserem Verständnis des Erregers, und damit auch unserer Möglichkeit ihn zu bekämpfen, im Wege steht. In Zeiten von Fake-news, Politikern, die die Krise ausnutzen um Falschinformationen und Missgunst zu sähen, sowie Zweifel und Unsicherheiten bezüglich der Virusmutationen und Impfungen, ist es durchaus legitim die Grundlagen zu hinterfragen:

„Wie können wir uns der Existenz von Viren sicher sein, wenn sie selbst zu klein für ein Mikroskop sind.“

Diese Frage beschreibt ein naturwissenschaftliches Problem, vor dem Mikrobiologen und Ärzte bereits im 19. Jahrhundert standen.

Hier werden wir uns auf die Suche nach den Beweisen für die Existenz von Viren machen, und auf dem Wege gleich die beiden Methoden betrachten, die die Wissenschaftler anwandten, um die Viren zu finden und ihre Eigenschaften zu bestimmen.

Methode 1: Beweis durch Kausalität

Lasst uns zunächst einen Blick auf das Tollwutvirus werfen: Übertragen wird es üblicherweise durch den Biss von befallenen Tieren. Bis die Krankheit daraufhin im gebissenen Menschen ausbricht vergehen ein bis drei Monate. Nachdem dann die ersten Symptome aufgetreten sind, weist Tollwut eine Tödlichkeit von 100% auf. Diese Symptome reichen anfangs von Fieber, intensiven Schmerzen und einem wildgewordenen Verdauungstrakt bis im späteren Verlauf zu Hyperaktivität und Hydrophobie. Dieses letzte Symptom beschreibt eine starke Abneigung gegenüber Wasser: die infizierte Person möchte den eigenen Speichel nicht mehr schlucken und fühlt sich generell unwohl in der Nähe von Flüssigkeiten. Tollwut ist eine schreckliche Krankheit, und Ärzte wie Wissenschaftler haben jahrelang nach der Ursache gesucht. Und selbst, nachdem Bakterien gefunden und als Erreger (oder auch Pathogene) für viele Krankheiten identifiziert wurden, blieb die Ursache für Tollwut ein Mysterium.

Die Wissenschaftler damals mussten sich also fragen: Wenn kein Bakterium als Ursache für Tollwut gefunden werden konnte, was ist dann die Ursache? Ist das Pathogen den Bakterien zumindest ähnlich, oder einfach so andersartig, dass es mit nichts Bekanntem vergleichbar ist? Hat Tollwut überhaupt eine physische Ursache?

Luis Pasteur. Bild von Ernest Board Lizenz: CC BY 4.0.

Luis Pasteur, ein französischer Mikrobiologe, ist bei seinen Versuchen den Antworten zu diesen Fragen bereits im 19. Jahrhundert auf der Spur gewesen und einen großen Schritt näher gekommen. Erfolge mit Milzbrand und Geflügelcholera hatten ihn bereits als eine wichtige Instanz der Medizin und Mikrobiologie etabliert, und doch war auch seine Suche nach dem Tollwutpathogen durch die Begrenzungen der damaligen Mikroskopietechniken zum Scheitern verurteilt.

Die Schwere und der immer tödliche Verlauf der Tollwutkrankheit veranlassten Pasteur aber dennoch dazu nach einem Impfstoff zu suchen. Einem Impfstoff gegen ein Pathogen, für dessen Existenz er außer den Krankheitssymptomen keinen Hinweis hatte. Aber indem er aus seinen Erfahrungen mit bakteriellen Erregern schöpfte schaffte er es sogar: Er umging die Notwendigkeit den Erreger zu isolieren, indem er stattdessen infiziertes Nervengewebe verwendete, um die Krankheit schrittweise an unterschiedliche Säugetierspezies wie Hasen oder Hunde weiterzugeben. Mit jedem dieser Infektionszyklen verringerte sich die Schädlichkeit und Infektiosität (also Virulenz) des Virus gegenüber dem Menschen. Im Jahre 1885, nur wenige Jahre nachdem er den entwickelten Impfstoff an Hunden testete, rettete Pasteur mit der Impfung das Leben des neunjährigen Jungen Joseph Meister, welcher dadurch vermutlich die erste Person war, die jemals gegen Tollwut immun war. 

Hunde, die loyalen Begleiter des Menschen seit der Steinzeit, haben uns seitdem nicht nur mit Jagen und Kuscheln geholfen… Bild von Pixabay.

Die Tatsache, dass Pasteurs Impfstoff - ohne dass die wahre Natur des Tollwuterregers bekannt war - Menschen (und Hunde) vor einem Ausbruch der Tollwut schützen konnte, zeigte, dass die Art und Weise mit der ein Tollwuterreger mit unserem Körper kommuniziert zumindest damit vergleichbar ist, wie Bakterien es tun. Was gleichzeitig beweist, dass der Erreger physisch, und daher auffindbar sein muss.

Die Entwicklung des Chamberland Filters von Pasteurs damaligem Assistenten Charles Chamberland, grenzte die möglichen Eigenschaften des Tollwuterregers weiter ein. Das Herzstück des Filters ist eine einseitig geöffnete Porzellanröhre, durch die eine Flüssigkeit gefiltert werden kann, wenn sie mit genügend Druck in die Röhre hineingeführt wird.

Dieser Filter war in der Lage, alle bekannten und beobachtbaren Mikroorganismen, inklusive pathogener Bakterien, von einer Flüssigkeit zu trennen. Der russische Biologe Dimitry Iwanowski, der sich mit der Mosaikkrankheit von Pflanzen beschäftigte, filterte 1892 den extrahierten Saft infizierter Blätter mit einem solchen Filter. Die gefilterte Flüssigkeit - unter dem Mikroskop scheinbar frei von jeglichen Partikeln – war nach Iwanowskis Beobachtung jedoch immer noch in der Lage, gesunde Pflanzen zu infizieren. Außerdem beobachtete er, dass anders als ein isolierter Bakterienstamm, der nach einiger Zeit in der Flasche ohne Nährstoffe abstirbt und seine Infektiosität verliert, das Filtrat für viele weitere Monate infektiös blieb. Diese Versuche enthüllten die nervige Fähigkeit der Viren ohne Stoffwechsel zu „überleben“.

Komponenten eines Pasteur-Chamberland Filters, wie im Science History Institute ausgestellt. Der weiße Zylinder ist eine Porzellanröhre mit einer Öffnung für eine Flüssigkeit auf der Oberseite. Fest verankert und versiegelt in dem größeren Zylinder (links im Bild) kann mit genügend Druck einfließendes Wasser durch die Porzellanröhre gefiltert werden. Das Filtrat verlässt den Filter auf der Unterseite. Bild vom Science History Institute, lizensiert unter CC BY-SA 3.0.

Dieses Experiment wurde mit vielen anderen Krankheiten wiederholt, ebenso auch mit Tollwut. Der Holländische Mikrobiologe Martinus Beijerinck führte 1898 zunächst das Wort „Virus“ für diese infektiösen Flüssigkeiten ein (vom lateinischen – virus: „Gift, Schleim“). Und auch wenn die Wissenschaftler sich nicht sicher waren, ob die Erreger flüssig oder partikelartig sind, wusste man zumindest, dass sie in Wasser löslich sein müssen und klein genug, um durch den Chamberland Filter zu passen. Dies ist ein sehr gutes Bespiel dafür, wie Wissenschaftler die Existenz einer unbekannten Sache demonstrieren, ohne sie zu sehen, sondern nur durch die Beobachtung der Auswirkungen, die diese unbekannte Sache auf ihre Umwelt hat.  Ein Beweis durch Kausalität. Sogar einige Annahmen zur wahren Natur der unbekannten Sache waren den Wissenschaftlern in diesem Beispielfall möglich.

Aber „Der Mensch glaubt nur das, was er sieht.“, daher lasst uns mit unserer Suche fortfahren, diesmal nach einem visuellen Beweis:

Methode 2: Beweis durch Visualisierung.

In den Jahren nach der Entdeckung dieser infektiösen Flüssigkeiten – „Viren“ genannt – hat sich die Mikroskopietechnik immer weiterentwickelt, bis zu dem Punkt, an dem geklumpte Häufchen von Viruspartikeln tatsächlich sichtbar gemacht werden konnten. Einige Wissenschaftler sahen diese Partikelklumpen vermutlich, ohne sie als die Erreger identifizieren zu können, die sie waren. Alles in Allem waren Vergrößerung und Auflösung noch nicht gut genug, um Details oder Strukturen zu erkennen. Dies liegt an dem natürlichen physikalischen Auflösungslimit von Lichtmikroskopen. Um dies zu erläutern und den anschließenden Schritt besser zu verstehen, müssen wir einen kurzen Exkurs machen und uns anschauen, wie Licht und Materie interagieren:

Licht kann als Welle betrachtet werden. Reflektion, Brechung und Beugung sind, neben Absorption und Emission, die Hauptinteraktionen zwischen Wellen und Materie und erlauben uns letztendlich zu Sehen. Was all diese Mechanismen allerdings gemeinsam haben ist, dass sie zu einem gewissen Grad von dem Größenunterschied zwischen der Wellenlänge und dem angestrahlten Objekt abhängig sind. Objekte, die deutlich kleiner sind als die Wellenlänge des Lichts, werden von den Lichtwellen einfach „ignoriert“. Da Wellen jeglicher Art viele Eigenschaften teilen, können wir uns hier zur Veranschaulichung den Vergleich mit Wasserwellen zu Nutze machen: Stellt euch einige, etwa einen Meter große Felsen in der Brandung am Strand vor. Betrachtet man lediglich die Wellen, die am Strand ankommen, könnte man bereits Annahmen über Größe und Position der Felsen im Wasser treffen. Stellen wir uns nun eine 20 m hohe Riesenwelle vor wie sie auf die Felsen und den Strand zurollt. Sie würde einfach über die Felsen hinwegfegen, ohne dass man danach anhand der Form der Welle auf die Existenz der Felsen schließen könnte. Ähnlich verhält sich dies auch bei Lichtwellen und Objekten, die viel kleiner als die Wellenlänge sind.​*​ Um Zahlen zu nennen: Das Spektrum von Licht, das in der Lichtmikroskopie genutzt wird, reicht von Wellenlängen ab 700 nm bis ca. 400 nm. Wenn wir die Wellen-Objektwechselwirkungen und die Lichtführung in einem Mikroskop berücksichtigen und etwas Mathematik hinzuziehen, dann können wir das theoretische Auflösungslimit eines Lichtmikroskops zu etwa 250 nm berechnen. Das heißt, dass unter einem hochmodernen Mikroskop Strukturen ab einer Größe von 250 nm voneinander unterschieden werden können. Aber selbst heutzutage ist es sehr kostspielig und ressourcenintensiv, diesem Auflösungslimit nahe zu kommen. Und die meisten Viren sind ohnehin kleiner. Das SARS-CoV-2 Virus hat einen Durchmesser von ungefähr 120 nm, das ist weniger als die Hälfte des theoretisch möglichen Auflösungslimits.

Nun verstehen wir, warum uns das Lichtmikroskop nicht bei der Visualisierung von Viren helfen kann. Aber, welche anderen Instrumente stehen uns zur Verfügung?

Ich stelle vor: das Elektronenmikroskop!

Photo of the first EM-Microscope as its exhibited in "Deutsches Museum". It is large.
Erstes Elektronenmikroskop mit einer höheren Auflösung als ein Lichtmikroskop. Von Ernst Ruska, 1980. Derzeit ausgestellt im Deutschen Museum in München. Bild von J. Brew, Lizenz DFDL.

Dieses revolutionäre Gerät wurde von den deutschen Wissenschaftlern Max Knoll und Ernst Ruska im Jahre 1931 entworfen. Kurz zuvor wurde die Hypothese des französischen Physikers Lois de Broglie, darüber das Partikel auch Wellencharakter annehmen können, weltweit bekannt. Diese Hypothese besagt außerdem, dass die Wellenlänge des Partikels sich mit zunehmender Geschwindigkeit weiter verkürzt. Sehr viel kürzere Wellenlängen als die 250 nm des Lichtmikroskops waren somit plötzlich möglich. Mit diesem Konzept arbeitet das Elektronenmikroskop und umgeht das Problem der „zu großen“ Wellenlängen von Licht, indem es sich den Wellencharakter stark beschleunigter Elektronen zu Nutze macht. Die optischen Linsen aus dem Lichtmikroskop werden hier durch magnetische Linsen – also Spulen - ersetzt, die Elektronen mit magnetischen Feldern leiten und fokussieren. Nachdem die Elektronen die Probe passiert haben, werden sie auf einem Fluoreszenzschirm aufgefangen, der die Elektronen detektiert und in für uns sichtbare Signale übersetzt.

Da Elektronen theoretisch bis nahe an die Lichtgeschwindigkeit beschleunigt werden können, könnten auch ihre Wellenlängen weiter und weiter verkürzt werden, so dass das theoretische Auflösungslimit unbegrenzt ist. Relativistische Effekte, exponentiell steigende Energiekosten für Beschleunigungen nahe der Lichtgeschwindigkeit und technische Aspekte der magnetischen Linsen beschränken das Auflösungslimit jedoch zu immer noch unfassbar kleinen 0,1 – 0,2 nm.

Die Entwicklung des Elektronenmikroskops öffnete der Wissenschaft die Türen zu kleineren Ebenen des Mikrokosmos, und wie der Zufall es wollte, war Ernst Ruskas Bruder, Helmut Ruska, ein Arzt und Biologe. Sehr früh bereits bemerkte dieser das Potential der Erfindung seines Bruders für die Mikrobiologie, und zusammen mit einem Kollegen, Bodo von Borries, publizierten sie im Jahr 1938 das erste mit einem Elektronenmikroskop aufgenommene Bild eines Virus.

EM-electrograph of Ectromelia-Virus particles.
EM Bild des Ektromelie - Virus, ein Virus das Mäusepocken auslöst. Es wurde 1930 entdeckt, und dieses Bild wurde 8 Jahre später aufgenommen und als erste Mikroskopie eines Virus publiziert. Bild aus "Klinische Wochenschrift 17.27 (1938): 921-925.".

Es folgte ein “Goldenes Zeitalter“ für die Virologie, in dem das Elektronenmikroskop nach und nach die wahre Natur der Viren enthüllte und den Wissenschaftlern erlaubte deren Funktionsweise zu verstehen und wie sie zu klassifizieren sind.

Und das neue Coronavirus?

Wir springen ins Jahr 2020: Die Weiterentwicklung des Elektronenmikroskops wurde in den letzten 90 Jahren vorangetrieben, neue Techniken entwickelt und bestehende Techniken verfeinert. Nach dem Aufkommen des Coronavirus zu Beginn des Jahres war es also nur eine Frage der Zeit, bis EM-Bilder des SARS-CoV-2 Virus veröffentlicht wurden. Ein unschlagbarer Beweis für die Existenz des Virus!

Coloured version of a SARS-CoV-2 electrograph.
Transmissions-Elektronenmikroskopie eines SARS-CoV-2 Virus. Bild von NIAID-RML.

Weiterlesen und Quellen:

Von Borries, B., E. Ruska, und H. Ruska. "Bakterien und Virus in übermikroskopischer Aufnahme." Klinische Wochenschrift 17.27 (1938): 921-925.

Ackermann, Hans-W., und Hans-W. Ackermann. "The first phage electron micrographs." Bacteriophage 1.4 (2011): 225-227.

Knoll, Max, und Ernst Ruska. "Das elektronenmikroskop." Zeitschrift für physik 78.5-6 (1932): 318-339.

Kruger, D. H., Peter Schneck, und H. R. Gelderblom. "Helmut Ruska and the visualisation of viruses." The Lancet 355.9216 (2000): 1713-1717.

Horzinek, Marian C. "The birth of virology." Antonie van Leeuwenhoek 71.1-2 (1997): 15-20.



  1. ​*​
    Diese Analogie ist zwar nicht zu 100% genau, aber konzeptuell richtig, und reicht hier aus.

Leider steht für diesen Artikel keine deutsche Übersetzung zur Verfügung.

Introduction

It is known as VUI‑202012/01 or B.1.1.7 – the new mutation of the coronavirus Sars-CoV-2. It may be responsible for a sharply increased number of infections in the southeast of England (​1​), however, the scientific results leading to very strict lockdown measurements in the south of the UK, and travel restrictions across Europe are few and far between. Here, we have compiled what is known up until now.

On mutations

Mutations are normal in the evolution of life – and of viruses. If two similar viruses have infected the same cell, their genomes can become mixed-up, one of the reasons why animal influenza strains are considered so dangerous. This is also called recombination. Mutations can be caused by chemicals, radiation (including UV light) and errors during genome copying. A typical SARS-CoV-2 virus accumulates two amino acid changes per month in its genome — a rate of change about half that of influenza (​2​). This is because SARS-CoV-2 can repair RNA to some extent. But even so, this natural process led to thousands of mutations since the beginning of the pandemic. If they affected the virus life cycle negatively, that strain may have likely died out - if they did not make a difference or enhanced its chances of survival, it may have persisted.


Nextstrain interface as of 22/12/2020: Mutations happen a lot. Screenshot by Andrea Thorn / Coronavirus structural Task Force.
SARS-CoV-2 mutations as of 22/12/2020: Mutations happen a lot. A very good interface to the genetic variants of SARS-CoV-2 is https://nextstrain.org/ncov/global. Screenshot by Andrea Thorn / Coronavirus structural Task Force.

Many mutations that are observed occur in the spike protein, which both serves to recognize potential host cells but is also what is being recognized by antibodies (i.e., the immune system).

Changes here can be crucial for the survival of the virus (“evolutionary pressure”) as they could significantly alter its affinity to the human receptor ACE2, which the virus uses as gateway to our cells.

Animation of spike protein binding the host cell and the molecular mechanism merging host cell and virus. CC-BY-NC Coronavirus Structural Task Force / Iwasa Lab

What vaccines do

Most, if not all, potential COVID-19 vaccines expose our body to some part of the spike protein, which can be made by the body itself (mRNA vaccines) or carried by a harmless virus instead of SARS-CoV-2 (vector). Our body then produces antibodies which specifically recognize the spike and persist for several months. If we are exposed afterwards to the real virus, the body can recognize it immediately – and the risk of infection is much lower as the immune system swings into action immediately. Earlier this year, the spike mutation D614G (amino acid residue number 614 changing from aspartic acid (D) to glycine (G)) caused quite a stir in the media, and became the predominant form of SARS-CoV-2 (​2​, 3). However, if and in how far this was caused by natural selection is still debated (​3​). Another example which triggered an increased media coverage was the mutation Spike Y453F, which originated from infected minks in Denmark (​4​) and led to a culling of millions of animals. In any case, if we would be vaccinated with a spike protein form that would be different from the one in a virus we encounter later, there is a small chance that the vaccine may be rendered ineffective. This chance is, however, small for SARS-CoV-2, in any case much smaller than for HIV, which famously evaded any attempt to develop a vaccine.

Model of spike (green) with bound antibody (yellow). Both models can be 3D printed (Instructions).  Photo CC-BY-NC 2020 Andrea Thorn / Coronavirus Structural Taskforce.
Model of spike (green) with bound antibody (yellow). Both models can be 3D printed (Instructions). Photo CC-BY-NC 2020 Andrea Thorn / Coronavirus Structural Taskforce.

What do we know?

There was a steep rise in infections in the UK recently, as in most other European countries.

A new mutation of the virus has emerged and seems to replace the old version of SARS-CoV-2 (​5​). Thousands of patients have been found to carry this variant.

This new variant has more mutations at once than expected. These mutations have not observed in this combination before.

The variant has been reported in the UK, the Netherlands, Denmark, Australia and Belgium so far.

What is striking to me as scientist about these findings is one thing in particular: How could the British government find that thousands of people were having the new SARS-CoV-2 variant, instead of the old, if the illness does not look any different? Sequencing samples from each and every patient would be technically very challenging, if not impossible. How could they know? The answer is:

Serendipity

The main PCR test employed in the United Kingdom is Thermo Fisher's TaqPathCOVID-19. This test identifies RNA on three different genome locations: In ORF1ab, nucleotide and spike. Now, it stopped working for the spike portion of the test, while the other two RNAs were still found to be present, which likely prompted scientists to sequence some of the samples in question. And indeed, the new mutant has a deletion of histidine-69 and valine-70, called 69-70del. This permitted easy differentiation of patients with the old SARS-CoV-2 (3 hits) and the new (2 hits) and is the reason why we know so much about the epidemiology of this variant!​*​ It has also to be said that this test is not used as often in other countries, such as Germany, and this could well be the reason why we do not know if and how widespread it is here. In addition, other countries sequence much smaller proportions of virus isolates than the UK, so ongoing circulation of this variant outside of the UK cannot be excluded.

The details of the mutation

The new variant of SARS-CoV-2 VUI-202012/01 has 14 amino acid changes and three deletions affecting the genes for ORF1ab, spike and ORF8. One of these mutations (N501Y) occurs in the receptor binding domain and could lead to an increased binding affinity to the human ACE2. The 69-70 deletion has likely an immunological role and is the reason this mutant was detected so widely, as this RNA location is used for PCR tests. Another interesting mutation is the P681H, which is next to a furin cleavage site that has a biological significance in membrane fusion. These mutations could be responsible for the increased transmissibility. The effects of the other mutations aren’t fully investigated yet. Here is a list of the mutations which have been observed in the VUI‑202012/01 or B.1.1.7 variant:

T1001I in gene ORF1ab
A1708D in gene ORF1ab
I2230T in gene ORF1ab
SGF 3675-3677 deletion in gene ORF1ab
A1708D in gene ORF1ab
HV 69-70 deletion in spikeThe 69-70 deletion on the spike protein is a re-occurring mutation that has shown to often co-occur with other amino acid changes in the RBD (​6​, 7).
(1) Evasion to the human immune response and in association with other receptor binding domain changes (​1​)
(2) Immunological role (​8​)
(3) Leads to diagnostic failures which permit detection (see above, "Serendipity")
(4) Associated with immune escape in immunocompromised patients (​9(​8​))
Furthermore, the 69-70 deletion arose in multiple unrelated lineages and is associated with the evasion of the immune response (​9​). It is being hypothesized that this mutation undergoes a strong positive selection when exposed to convalescent plasma therapy in an immunocompromised human host (​7​).
Y144 deletion in spikeDeletion in the spike N-terminal domain (​9​)
N501Y in spikeOne of six key contact residues in the spike receptor binding domains, this mutation leads to an increasing binding affinity to human and murine ACE2 (​1​).
A570D in spikeMutation located at the spike receptor binding domain (​10​)
P681H in spikeThe P681H mutation is located directly next to the furin cleavage site. It is one of the four residues which are insertions when compared to closely related coronaviruses, creating a furin cleavage site in the spike protein between the spike S1 and S2 domains. This prompts the entry of the virus into respiratory epithelial cells as well as the transmission in animal models (​1​)
The S1/S2 furin cleavage site of SARS-CoV-2 is not found in closely related coronaviruses and has been shown to promote entry into respiratory epithelial cells and transmission in animal models (​9​)
T716I in spikeMutation in in the S2 domain
S982A in spikeMutation in in the S2 domain (​10​)
D1118H in spikeMutation in in the S2 domain (​8​)
Q27 stop in ORF8The Q27stop mutation in the ORF8 leads to the truncation of the ORF8, and as it only consists of 121 amino acids, the consequence might be a loss of function. These and the other mutations could be responsible for the increased transmissibility of the B.1.1.7 variant. In any case, this mutation truncates the ORF8 protein at residue 27 or renders it inactive which allows further downstream mutations to accrue. (​1​)
R52I in ORF8
Y73C in ORF8
D3L in nucleocapsid
S235F in nucleocapsid
picture of Spike mutation sites from the COVID-19 Genomics UK Consortium
Spike mutation sites. Picture by the COVID-19 Genomics UK Consortium (​9​).

Why were there so many mutations at once?

This could be a result of prolonged or chronical SARS-CoV-2 infections as study of these infections reveal unusually large numbers of nucleotide changes and deletion mutations and often high ratios of non-synonymous changes. In addition to this, convalescent plasma treatment can cause intra-patient virus genetic diversity (​11​).

What does the new mutation mean in terms of impact and epidemiology?

There was an increase in cases with the new strain in total and in

proportion to the old (​1​). What does that mean for us?

This is what the internet says:

The COVID-19 genomics UK consortium (COG) reports about a “priority set of SARS-CoV-2 Spike mutations that are of particular interest based on potential epidemiological significance in the UK and/or biological evidence based on the literature or unpublished work.” (​9​)

The New and Emerging Respiratory Virus Threats Advisory Group of the British government (NERVTAG) discussed the new variant on Friday and concluded that its growth rate is higher by 67-75% and that this is likely due to a selective advantage. “In summary, NERVTAG has moderate confidence that VUI-202012/01 demonstrates a substantial increase in transmissibility compared to other variants.” (​12​) This is very likely the source of Boris Johnson’s claim to this strain being “70% more infectious”.

The English government writes that PHE (Public Health England) „is working with partners to investigate and plans to share its findings over the next 2 weeks. There is currently no evidence to suggest that the variant has any impact on disease severity, antibody response or vaccine efficacy. High numbers of cases of the variant virus have been observed in some areas where there is also a high incidence of COVID-19. It is not yet known whether the variant is responsible for these increased numbers of cases.” (​13​)

Conclusion

From this, we conclude that the British government, and we, do not know yet. It has not been conclusively shown that the new variant is more infectious (likely), has an easier time to evade the host immune system or if the vaccine will be less effective against it (very unlikely). The epidemologic model which predicts a higher tranmissability has still to be published, the science is still in the making. Tests of vaccines against the new variant are ongoing and will take a few weeks. There is yet little evidence that this new variant poses a significantly bigger threat than others - or to the contrary.

Acknowledgements

While I am listed as author of this article, it could not have been written without the help and research by Pairoh Seeliger, Lea von Soosten, Luise Kandler, Erik Nebelung and Oliver Kippes who all helped in this.
I would also thank Nicolai Wilk from Thermo Fisher Scientific who quickly responded to my questions about their test.


The title picture shows mutation cards from the game Pandemic Expansion: On the Brink by Z-Man Games.


  1. ​*​
    The 69-70del mutation is predominantly observed in B.1.1 (including B.1.1.7), B.1.258, and the cluster 5 variant lineages of SARS-CoV-2.

References

  1. 1.
    A. Rambaut, Preliminary genomic characterisation of an emergent SARS-CoV-2 lineage in the UK defined by a novel set of spike mutations. virological.org (2020), (available at https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike-mutations/563).
  2. 2.
    E. Callaway, The coronavirus is mutating — does it matter? Nature, 174–177 (2020).
  3. 3.
    L. Zhang, C. B. Jackson, H. Mou, A. Ojha, H. Peng, B. D. Quinlan, E. S. Rangarajan, A. Pan, A. Vanderheiden, M. S. Suthar, W. Li, T. Izard, C. Rader, M. Farzan, H. Choe, SARS-CoV-2 spike-protein D614G mutation increases virion spike density and infectivity. Nat Commun (2020), doi:10.1038/s41467-020-19808-4.
  4. 4.
    ECDC, Detection of new SARS-CoV-2 variants related to mink. www.ecdc.europa.eu (2020), (available at https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/RRA-SARS-CoV-2-in-mink-12-nov-2020.pdf).
  5. 5.
    ONS UK , Percentage of COVID-19 cases that are positive for ORF1ab and N genes. www.ons.gov.uk (2020), (available at https://www.ons.gov.uk/peoplepopulationandcommunity/healthandsocialcare/conditionsanddiseases/adhocs/12690percentageofcovid19casesthatarepositivefororf1abandngenes).
  6. 6.
    R. M. Dawood, M. A. El-Meguid, G. M. Salum, K. El-Wakeel, M. Shemis, M. K. El Awady, Bioinformatics prediction of B and T cell epitopes within the spike and nucleocapsid proteins of SARS-CoV2. Journal of Infection and Public Health (2020), doi:10.1016/j.jiph.2020.12.006.
  7. 7.
    S. A. Kemp, D. A. Collier, R. Datir, S. Gayed, A. Jahun, M. Hosmillo, I. A. Ferreira, C. Rees-Spear, P. Mlcochova, I. U. Lumb, D. Roberts, A. Chandra, N. Temperton, K. Sharrocks, E. Blane, J. A. Briggs, K. G. Smith, J. R. Bradley, C. Smith, R. Goldstein, I. G. Goodfellow, A. Smielewska, J. P. Skittrall, T. Gouliouris, E. Gkrania-Klotsas, C. J. Illingworth, L. E. McCoy, R. K. Gupta, Neutralising antibodies drive Spike mediated SARS-CoV-2 evasion (2020), , doi:10.1101/2020.12.05.20241927.
  8. 8.
    K. Kupferschmidt, Mutant coronavirus in the United Kingdom sets off alarms, but its importance remains unclear. Science (2020), doi:10.1126/science.abg2626.
  9. 9.
    COG, COG-UK update on SARS-CoV-2 Spike mutations of special interest Report 1. https://www.cogconsortium.uk (2020), (available at https://www.cogconsortium.uk/wp-content/uploads/2020/12/Report-1_COG-UK_19-December-2020_SARS-CoV-2-Mutations.pdf).
  10. 10.
    S. Kemp, W. Harvey, R. Datir, D. Collier, I. Ferreira, A. Carabelii, D. L. Robertson, R. K. Gupta, Recurrent emergence and transmission of a SARS-CoV-2 Spike deletion ΔH69/V70 (2020), , doi:10.1101/2020.12.14.422555.
  11. 11.
    ECDC, Threat Assessment Brief: Rapid increase of a SARS-CoV-2 variant with multiple spike protein mutations observed in the United Kingdom. www.ecdc.europa.eu (2020), (available at https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/threat-assessment-brief-rapid-increase-sars-cov-2-variant-united-kingdom).
  12. 12.
    NERVTAG, NERVTAG meeting on SARS-CoV-2 variant under investigation VUI-202012/01. https://khub.net (2020), (available at https://khub.net/documents/135939561/338928724/SARS-CoV-2+variant+under+investigation%2C+meeting+minutes.pdf/962e866b-161f-2fd5-1030-32b6ab467896?t=1608470511452).
  13. 13.
    PHE, PHE investigating a novel variant of COVID-19 . www.gov.uk (2020), (available at https://www.gov.uk/government/news/phe-investigating-a-novel-variant-of-covid-19).

Die Pressemitteilung

Heute haben Pfinzer und BioNTech SE eine Pressemitteilung mit aufregenden Neuigkeiten veröffentlicht. Nachzulesen ist das hier.

Selbstredend haben sich die Presseagenturen und News-Outlets auf diese Neuigkeit gestürzt und die Meldung beschert uns Schlagzeilen wie „Meilenstein der Impfung bietet 90% Schutz“ (www.bbc.com, 09.11.2020, 17:00 GTM)
„Covid-19-Impfung ist zu 90% wirksam, sagt der Entwickler“ (www.cnn.com, 09.11.2020, 16:00 GTM)

Doch was steht denn wirklich in der Pressemitteilung?
Um das zu beantworten, muss man etwas genauer hinschauen:

Was steht denn da genau?

38.955 Menschen haben jeweils zwei Injektionen bekommen. Von diesen hat die Hälfte zweimal den richtigen Wirkstoff bekommen und die andere Hälfte zweimal ein Placebo.
Bei 94 von diesen 38.955 Menschen wurde später nachgewiesen, dass sie sich mit COVID-19 infiziert haben. Das sind 2,4%.

Aus der vielzitierten 90%-Angabe für die Wirksamkeit kann man davon ausgehen, dass sich von den 19.478 Menschen, die den echten Impfstoff erhalten haben, lediglich 9 infiziert haben, während es in der Placebogruppe 85 Menschen waren: 85/94 = ca. 90%

Das bedeutet wahrscheinlich, dass die Impfung funktioniert und eben das hat Pfizer veranlasst, die Pressemitteilung herauszugeben. Im Großen und Ganzen sind das also gute Neuigkeiten! Man muss aber auch berücksichtigen, dass die Gruppe von insgesamt 94 Erkrankten eher überschaubar ist.
Die Pressemitteilung weist auch darauf hin, dass die Studie erst abgeschlossen ist, wenn insgesamt 164 Studienteilnehmer sich mit COVID-19 infiziert haben.
Die Zahl 164 wurde aller Wahrscheinlichkeit nach gewählt, weil man zu diesem Punkt ziemlich sicher davon ausgehen gehen kann, dass ein Unterschied zwischen den Infektionen in der Impf- und in der Placebogruppe nicht nur dem Zufall geschuldet ist.

Trotzdem liegt noch ein weiter Weg vor uns. Sogar wenn der Impfstoff sich als effektiv und frei von schlimmen Nebenwirkungen erweist, wird es eine ganze Weile dauern, so viel davon zu produzieren, dass die ganze Welt geimpft werden kann.

Was alles noch schief gehen kann, zeigt der rechtliche Hinweis unter der Pressemitteilung anschaulich. Er ist mindestens so lang wie die Pressemitteilung selbst und enthaält so schöne Formulierungen wie “zu den Risiken und Unsicherhieten zählen (...) die Unsicherheiten, welche Forshcung und Entwicklung innewohnen" (Im Orginal: "risks and uncertainties include (…) the uncertainties inherent in research and development”) und "ob und wann irgendeine Anwendung von den zuständigen Behörden zugelassen wird, liegt an unzähligen Faktoren" (Im Original: “whether and when any such applications may be approved by regulatory authorities, which will depend on myriad factors”)

Ich bin verwirrt

Sogar ich als Wissenschaftlerin hatte Schwierigkeiten die Pressemitteilung zu verstehen. Teilweise ist sie verwirrend und überlässt viele Schlussfolgerungen dem Leser. Zum Beispiel: 43.538 Leuten wurde eine erste Dosis verabreicht, aber nur 38.955 die zweite. Wurden die 4.583 Leute, die nur die erste Dosis bekamen, in den Resultaten berücksichtigt?
Anscheinend nicht, da geschlussfolgert wird, dass „die Impfung 7 Tage nach der zweiten Dosis eine Effektivitätsrate von 90% aufweist“.

Es gab „94 auswertbare Fälle“ – heißt das, es gibt auch nicht auswertbare?

Die Antwort wird einem erst klar, wenn man sich das klinische Versuchsprotokoll ansieht, das in der Pressemitteilung verlinkt wird.
Dort wird „auswertbar“ definiert: „keine andere wichtige Protokollabweichungen von den klinischen Anforderungen“ und „Versuchspersonen stimmen mit den Schlüsselkriterien des Protokolls überein“.

Was bedeutet „ungefähr 42% der internationalen und 30% der US-amerikanischen Teilnehmer waren divers in Ethnie und Rasse"?

Was sind denn die 58%/70%, die nicht „divers“ sind? Ich persönlich gehe davon aus, dass mit divers „nicht weiß/kein europäischer Typ“ gemeint ist.

Fazit

Die Medien hätten sich mit ihrem Hype gut und gerne ein bisschen zurückhalten können – immerhin ist das hier immernoch Wissenschaft.
Aber, summa summarum, sind es gute Neuigkeiten, bei denen noch einiges schieflaufen kann.

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Ich möchte mich bei Sam Horrell, Dale Tronrud, Pairoh Seeliger und Florian Platzmann bedanken für anregende Diskussionen und Übersetzungshilfe bedanken.

Für diesen Beitrag exisitiert leider keine deutsche Übersetzung.

COVID-19 is caused by the new coronavirus SARS-CoV-2. This virus has a characteristic virus hull featuring surface proteins which are commonly called “spikes”. Protruding from the viral hull like “spikes of a crown”, they give the coronavirus its name (corona = crown).  These proteins make the first contact with human cells and are akin to keys that use a human receptor called “angiotensin-converting enzyme2” (ACE2) as a backdoor to gain access to and infect the cell.

SARS-COV2 Animated picture. Realistic surface and spike proteins with glycosylation. Image: Thomas Splettstoesser; www.scistyle.com
Fig. 1. SARS-COV2 Animated picture. Numerous spike proteins, coloured in green, protrude from the virus hull which is coloured in brown. Spikes enable the coronavirus to invade human epithelial cells. Image: Thomas Splettstoesser; www.scistyle.com

1. Fuction of ACE2

ACE2 is a membrane protein which is anchored in the human cell membrane of epithelial cells. This type of cells can be found on the surface of lung, intestine, heart and kidney tissue. As a type I membrane protein, its primary function is to take part in maturation of angiotensin, a peptide hormone which controls vasoconstriction and blood pressure. ACE2 can be compared to a lock which can be unlocked by the coronavirus spike protein. The virus can then enter the cell and hijack its functions to reproduce itself, thus causing the Covid-19 infection which poses a serious danger to humanity, especially for older people and people with pre-existing conditions. For this reason, one approach to combating SARS-CoV-2 is to target and inhibit the spike to prevent infection. In order to do so, knowledge of the structural features of the spike and its interaction processes with ACE2 are indispensable. (Further information about how macromolecular structures are visualized can be found on our homepage: https://insidecorona.net/visualizing-macromolecular-structures/)

2. Spike: Structure and Fusion Mechanism

Fig. 2. Image of a spike protein (green) protruding out of the viral envelope (brown). This image shows the structure of a spike protein divided into several subdomains. Each subdomain comprises a specific function necessary for binding and fusion. The transmembrane domain anchors the spike protein in the virus membrane.  Heptat repeat 1, 2 and the fusion peptide play key roles in mediation of the fusion process and with the RBD domain, the virus makes contact to human cells. Note that only “stumps” of carbohydrate chains are shown. Image: Thomas Splettstoesser; www.scistyle.com

The Spike protein has a trimeric shape comprising three identical monomeric structural elements. Each of these monomers can fold out akin to a modern car key with a fold-out key element with specific teeth on its surface. This fold-out key element is the so-called “receptor binding domain” (RBD). The spike can only interact with ACE2 when its RBD is in a folded-out position, exposing its teeth, or  “receptor binding motive” (RBM). As the name suggests, it comprises a motive of different amino acids which then can bind and unlock the ACE2 receptor. This key lock mechanism triggers a cascade of events initiating fusion with the host cell. First, protein scissors are recruited to the binding site. These scissors (furin & transmembrane serine protease 2) cleave the spike protein for subsequent activation. The active spike molecule then rearranges itself to form a long structural “hook” (formed of HR1/ HR2 and FP see Fig.2) that brings the epithelial cell and viral cell membrane into close proximity for fusion. Once the fusion is completed, the path for the virus is clear to transfer its genome encoded in ribonucleic acid (RNA) into the host cell. This successful transfer then enables the virus to multiply itself and finally spread from cell to cell, causeing Covid-19 in its wake.

Fig. 3. This image shows a spike protein in complex with the human ACE2 receptor. (PDB:6vsb/6lzg). Left: The structure of a spike protein coloured in orange in complex with the human ACE2 receptor coloured in light orange. The white box shows the interaction site which is shown enlarged in the image ion the right. Right: The interaction site between spike and ACE2. Spike's "receptor binding domain (RBD)" includes a "receptor binding motif (RBM)" whose amino acids interact with those of the human receptor through hydrophilic interactions. These amino acids are shown as sticks protruding from the RBM and ACE2. Image: Sabrina Stäb

3. Evading the Immune System with Carbohydrate Chains

The human immune system normally recognizes the surface proteins of foreign organisms such as viruses or bacteria and reacts with an immune response to combat them. Spike proteins are such surface proteins but because of structural peculiarities, the coronavirus evades both the innate and the adaptive human immune system. The secret of these structural peculiarities are the N-glycans. These are long carbohydrate chains which sit on spike’s surface.  Each spike comprises 66 N-glycans forming a protective shield around the protein. Hence the human immune system has problems recognizing spikes and identifying the coronavirus as an enemy.

Fig. 5. Ribbon diagrams of a spike trimer with N-glycans on its surface coloured in cyan (PDB: 6vxx). In Image a, the spike protein is shown sideways and in b, the trimer can be seen from above. Unfortunately, both X-ray crystallography and cryo-EM cannot resolve long carbohydrate chains, so the structures of the chains shown in Figure 4 contain a maximum of three sugar monomers, while in most cases, the carbohydrate chains are much longer, covering most of the contact surfaces of the upper spike protein. Image: Sabrina Stäb

The COVID 19 pandemic has a massive impact on our lives, our health and the global economy. Scientists around the world are trying to develop new drugs to combat the virus. Since the spike plays a critical role in the infection process, it is a prime target for drug development against the pandemic.  One drug approach to inhibit the interaction between spike and the ACE2 receptor is to cap the spike protein using antibodies. Antibodies are proteins, normally produced by the human immune system to fight viruses. The idea is to treat patients with antibodies that cap the RBD of spike, thus preventing interactions with ACE2. This would lead to a nonfunctional spike, blocking the coronavirus from entering the cell (The key would no longer fit the lock). Another approach includes the development of small molecules that target and inactivate the protein scissor transmembrane serine protease 2 (see chapter 2), as the spike’s functionality depends on its cleavage activity. Since the spike protein decorates the virus hull, it could even be part of a potential vaccine. For this reason,  the spike protein could also become the key in the molecular fight against COVID-19.

Alexander Matthew Payne und Binisha Karki

Einleitung

Haben Sie schon gehört, dass das Corona-Virus „mutiert“? Oder dass weltweit „mehr als ein Stamm“ dieses Virus existiert? Das klingt ziemlich erschreckend, nicht wahr? In Wirklichkeit mutiert aber wirklich alles - alle Organismen, angefangen bei Bakterien bis hin zum Menschen, verändern im Laufe der Zeit ihr Erbgut. Dies kann auch passieren, wenn die DNA (Deoxyribonucleic Acid, zu Deutsch: Desoxyribonukleinsäure) UV-Licht (wie dem der Sonne!) ausgesetzt wird oder während der Replikation der DNA. Bei diesem Vorgang verwendet eine Zelle einen der beiden DNA-Stränge als Vorlage für eine neue, komplementäre Kopie des anderen Strangs. Mutationen treten bei allen Lebewesen (und Viren) auf und sind die Triebkraft der Evolution. In diesem Beitrag befassen wir uns mit der Replikation von Coronaviren unter besonderer Berücksichtigung der beteiligten Proteine. 

Wie vermehrt sich das Coronavirus?

SARS-CoV-2 verwendet zur Kodierung seines Genoms nicht DNA, sondern einsträngige Ribonukleinsäure (Ribonucleic Acid, RNA) und wird deshalb der Klasse der „einsträngigen RNA-Viren“ zugeordnet. Aus diesem Grund muss das Virus zur Vervielfältigung seines Genoms einen anderen Weg beschreiten als „normale“ Zellen: Das für die Replikation der RNA zuständige Virusprotein wird als „RNA-abhängige RNA-Polymerase“ (RdRp) bezeichnet. Dieses Protein verwendet die virale RNA als Vorlage für neue Virus-RNA-Kopien; dabei reiht es einzelne Ribonukleotide wie Perlen auf einer Schnur aneinander. Dieser Vorgang wird als Polymerisation bezeichnet.

Eine Studie des AG Mors  an der Texas A&M University hat gezeigt, dass die SARS-CoV-2 RNA-Polymerase eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit der RNA-Polymerase von SARS-CoV (> 95 %) und MERS-CoV [1] hat, dem Virus, das das Middle East Respiratory Syndrome verursacht. Wir könnten also vielleicht von den Erkenntnissen aus der SARS- und MERS-Epidemien bei der Bekämpfung von SARS-CoV-2 profitieren. Mit kontinuierlichen Mitteln für die Coronavirus-Forschung in den letzten Jahren hätten wir vielleicht noch mehr über RdRp lernen können. In jedem Fall könnte RNA-Polymerase ein interessanter Ansatzpunkt für Medikamente zur Eindämmung von COVID-19 und zur Senkung der Sterblichkeitsrate sein…

Struktur der RNA-abhängigen RNA-Polymerase

Um ein Medikament so zu optimieren, dass es an dieses Protein bindet und es blockiert, muss man zunächst die Struktur von RdRp bestimmen und seine Funktionsweise umfassend verstehen – und in den vergangenen Monaten wurden hierzu verschiedene Strukturen der SARS-CoV-2 RNA-Polymerase aufgeklärt. 

Eine interessante Struktur zeigt die RNA-Polymerase in Aktion: dabei ist zu erkennen, wie ein RNA-Strang verlängert wird (siehe Abbildung 1). Es ist deutlich zu sehen, dass die Polymerase einen Komplex mit kleineren Proteinen, den so genannten Nichtstrukturproteinen 7 und 8 (nsp7 und nsp8), bildet. Diese Proteine stabilisieren die Bindung der RNA-Polymerase an die RNA-Vorlage und erhöhen die „Prozessivität“, also die Zeit, die das Enzym an der Vorlage kleben bleibt, bis es sich wieder ablöst. [3]

Abbildung 1. Vorder- und Rückansicht der Struktur mit RNA und den zwei Cofaktoren nsp7 und nsp8 während der Verlängerung durch RdRp (PDB ID: 6yyt). Zwei nsp8-Exemplare (grau) bilden seitliche Stützen zur Stabilisierung der RNA (orangefarben). Ein nsp8-Exemplar bindet direkt an die Polymerase (blau), während das andere nsp7 (rosa) zur Verankerung an einer zweiten Stelle der Polymerase nutzt. Bild von alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.
Abbildung 1. Vorder- und Rückansicht der Struktur mit RNA und den zwei Cofaktoren nsp7 und nsp8 während der Verlängerung durch RdRp (PDB ID: 6yyt). Zwei nsp8-Exemplare (grau) bilden seitliche Stützen zur Stabilisierung der RNA (orangefarben). Ein nsp8-Exemplar bindet direkt an die Polymerase (blau), während das andere nsp7 (rosa) zur Verankerung an einer zweiten Stelle der Polymerase nutzt. Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.
Abbildung 1. Vorder- und Rückansicht der Struktur mit RNA und den zwei Cofaktoren nsp7 und nsp8 während der Verlängerung durch RdRp (PDB ID: 6yyt). Zwei nsp8-Exemplare (grau) bilden seitliche Stützen zur Stabilisierung der RNA (orangefarben). Ein nsp8-Exemplar bindet direkt an die Polymerase (blau), während das andere nsp7 (rosa) zur Verankerung an einer zweiten Stelle der Polymerase nutzt. Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.

In der Mitte des Proteins befindet sich das „aktive Zentrum“, in dem der eigentliche Synthesevorgang stattfindet. Die Aminosäuren der Polymerase im aktiven Zentrum ermöglichen eine besonders hohe Polymerisationsrate. Die Polymerase kann bis zu 100 Nukleotide pro Sekunde aneinanderreihen [3]. RNA-Moleküle, die für die Produktion der RNA-Kette benötigt werden, gelangen durch ein Fenster in das aktive Zentrum. An dieser Stelle können nun antivirale Medikamente ansetzen:

Die dritte Ansicht zeigt den Zugang zum aktiven Zentrum, durch das neue Nukleotide ins Innere gelangen. bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.
Die dritte Ansicht zeigt den Zugang zum aktiven Zentrum, durch das neue Nukleotide ins Innere gelangen. Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.

Wie können antivirale Medikamente RNA-abhängige RNA-Polymerase hemmen?

Remdesivir ist das von der FDA zugelassene Medikament des Herstellers Gilead, welches im Fokus der Suche nach einem Heilmittel gegen COVID-19 steht. Remdesivir (das mit dem Entwicklungscode GS-5734 unter dem Markennamen Veklury vertrieben wird) ist ein „Nukleotid-Analogon“, also eine synthetisch hergestellte Substanz, die in Form und Chemie den Bausteinen von RNA und DNA (Nukleotiden) ähnelt (siehe Abbildung 4). 

Remdesivir wurde ursprünglich als generelles antivirales Medikamente entwickelt und zeigte in Labortests an Zellen und in klinischen Tests an Affen seine Wirksamkeit gegen das Ebolavirus [4]. Doch ist die Forschung dahingehend noch sehr jung und die Mühlen der Wissenschaft mahlen so langsam, dass bis zur COVID-19-Pandemie keine groß angelegten klinischen Studien mit Remdesivir durchgeführt wurden. Wissenschaftler und Ärzte wollten das Medikament schnell gegen COVID-19 einsetzen, um zu sehen, ob es auch hier half. Sowohl die USA als auch Japan erteilten dem Medikament bereits im Mai eine „Zulassung für die Anwendung in Notfallsituationen“ für Patienten mit schwerem COVID-19-Verlauf [5], [6].Woraufhin Remdesivir im Juli von der Europäischen Arzneimittelbehörde eine „bedingte Zulassung“ erhielt (welche für Medikamente vergeben wird, die eine medizinische Versorgungslücke schließen, aber über nicht genügend Daten für eine normale Zulassung verfügen). Damit kann Remdesivir bis zum nächsten Jahr bei Patienten mit schweren COVID-19-Verläufen eingesetzt werden [7].

Wie ist es denn aber möglich, dass ein Medikament gegen Ebola, Influenza oder eine andere Viruserkrankung auch bei COVID-19 hilft? Ich habe mir diese Frage immer und immer wieder gestellt, als die Studien über die Medikamentenwirksamkeit veröffentlicht wurden – und ich stand damit ganz sicher nicht alleine...

Die simple Antwort lautet: Alle diese Viren müssen ihr RNA-Genom vervielfältigen und verwenden hierzu das im Wesentlichen gleiche Werkzeug, nämlich eine RNA-abhängige RNA-Polymerase. Und alle Medikamente aus der Gruppe der Nukleotid-Analoga bemühen den gleichen Trick: sie geben sich als Ribonukleotide (also die eingangs beschriebenen „Perlen“) aus und gelangen so in das aktive Zentrum der RNA Polymerase. Im Inneren angekommen, docken sie dauerhaft am aktiven Zentrum an und bringen die Polymerase-Maschine zum Stillstand. Weil dieser Trick bei jeder viralen RNA-Polymerase funktionieren sollte, könnte man diese Wirkstoffe bei allen RNA-Viren als antivirale Medikamente einsetzen. In der Praxis sieht es natürlich etwas anders aus, weil zwischen den verschiedenen RNA-Polymerasen eben doch Unterschiede bestehen. Aber es ist ein guter Ausgangspunkt. Wenn wir über einsatzbereite allgemeine Virostatika gegen SARS-CoV-2 verfügen, sind wir vermutlich besser für einen künftigen Coronavirus-Ausbruch gerüstet!

Remdesivir Meme.
Wahrscheinlich sehen wir alle nur, was wir sehen wollen. Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.

Abbildung 3. Wahrscheinlich sehen wir alle nur, was wir sehen wollen.

Die Chemie von Remdesivir

In seiner Struktur ähnelt Remdesivir dem Nukleotid Adenosin, doch einige ausgeklügelte chemische Anhänge machen es zu einem besonders raffinierten Medikament (vielen Dank an die medizinische Chemie!). Wird Remdeivir injiziert, gelangt es in unsere Zellen, die es als Fremdkörper erkennen und zu verdauen versuchen. Dabei entfernen die Zellen allerdings nur die chemischen Anhänge. Was übrig bleibt, halten sie fälschlicherweise für ein normales Adenosin. In infizierten Zellen bindet nun die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase dieses Moleküle und baut es anstelle von Adenosinmolekülen in den neu synthetisierten RNA-Strang ein. Remdesivir wird Teil der RNA, blockiert die Polymerase und verhindert, dass das Virus weitere Kopien seines Erbguts anfertigen kann. Dadurch kommt die Virusreplikation letztlich zu einem Stillstand und hilft dem Patienten, das Virus zu bekämpfen.

Abbildung 4. (A) Der rote Bereich macht Remdesivir so wirkungsvoll, weil er dem Wirkstoff Zugang aus dem Blut in die menschlichen Zellen verschafft, aber für die Blockade der Polymerase nicht gebraucht wird. Remdesivir wurde speziell so konzipiert, dass menschliche Zellen versuchen, es zu verstoffwechseln, sobald sie es in ihrem Inneren bemerken. Dabei spalten sie den roten Bereich ab, wodurch es dem Adenosinnukleotid zum Verwechseln ähnlich wird. (B) Das veranlasst die Zelle, dem Molekül zwei weitere Phosphatgruppen hinzuzufügen, so dass die Triphosphat-Form entsteht. In dieser aktiven Form ähnelt das Molekül ATP (C) und wird anstelle von ATP in die wachsende RNA-Kette integriert. Der blau markierte Teilbereich an der Seite ist eine so genannte 1’-Cyanogruppe und dafür verantwortlich, dass sich die RNA untrennbar mit der Polymerase verbindet und diese effektiv blockiert; außerdem ist der Ring unterschiedlich (ebenfalls blau). Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.
Abbildung 4. (A) Der rote Bereich macht Remdesivir so wirkungsvoll, weil er dem Wirkstoff Zugang aus dem Blut in die menschlichen Zellen verschafft, aber für die Blockade der Polymerase nicht gebraucht wird. Remdesivir wurde speziell so konzipiert, dass menschliche Zellen versuchen, es zu verstoffwechseln, sobald sie es in ihrem Inneren bemerken. Dabei spalten sie den roten Bereich ab, wodurch es dem Adenosinnukleotid zum Verwechseln ähnlich wird. (B) Das veranlasst die Zelle, dem Molekül zwei weitere Phosphatgruppen hinzuzufügen, so dass die Triphosphat-Form entsteht. In dieser aktiven Form ähnelt das Molekül ATP (C) und wird anstelle von ATP in die wachsende RNA-Kette integriert. Der blau markierte Teilbereich an der Seite ist eine so genannte 1’-Cyanogruppe und dafür verantwortlich, dass sich die RNA untrennbar mit der Polymerase verbindet und diese effektiv blockiert; außerdem ist der Ring unterschiedlich (ebenfalls blau). Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.
Abbildung 5. Struktur von Remdesivir (cyan) im aktiven Zentrum der RNA-abhängigen RNA-Polymerase. Der Zugang, durch den neue Nukleotide in das Innere gelangen, befindet sich links unten im Bild. Der als Vorlage dienende RNA-Strang (orange) erscheint von rechts unten. Remdesivir wird durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Uracil zu einem Basenpaar verbunden. Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.
Abbildung 5. Struktur von Remdesivir (cyan) im aktiven Zentrum der RNA-abhängigen RNA-Polymerase. Der Zugang, durch den neue Nukleotide in das Innere gelangen, befindet sich links unten im Bild. Der als Vorlage dienende RNA-Strang (orange) erscheint von rechts unten. Remdesivir wird durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Uracil zu einem Basenpaar verbunden. Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.

Ein anderes Medikament, das die RNA-Polymerase-Aktivität hemmt, ist Favipiravir, das unter den Markennamen Avigan, Abigan und FabiFlu vertrieben wird. Favipiravir wurde von Toyama Chemical Co. Ltd. in Japan entdeckt und wirkt ähnlich wie Remdesivir, allerdings imitiert es statt eines Adenosin-Nukleotids ein Guanosin- Nukleotid [8]. Dieses Medikament wurde bereits 2014 in Japan für den Einsatz bei resistenten Fällen von Influenza A und B zugelassen, wartet in den USA (erst in der klinischen Phase II und III) und in Großbritannien allerdings noch auf seine Freigabe [9]. Außerdem wird das Medikament in 43 Ländern für den Einsatz getestet. Die Zulassung von Favipiravir als COVID-19-Medikament erfolgte in einigen Ländern sehr rasch. So erteilte China am 15. März 2020 die Freigabe, Russland am 3. Juni 2020 und Indien am 20. Juni 2020 [10], [11]. Andere Länder, wie Japan, befinden sich noch in unterschiedlichen klinischen Teststufen und die Ergebnisse werden bis Ende Juli 2020 erwartet [10].

Heißt das, wir haben ein Heilmittel gegen SARS-CoV-2?

Leider noch nicht. Zwar hat Remdesivir die klinischen Studien mit beispielloser Geschwindigkeit durchlaufen, doch ist noch mehr Arbeit nötig, um sicher sein zu können, dass es unbedenklich und vorallem auch wirksam ist. Insgesamt wurden noch nicht besonders viele Menschen mit Remdesivir behandelt, so dass wir nicht wirklich sagen können, welche Nebenwirkungen es haben kann; zuletzt gab es Hinweise auf eine Schädigung von Leber und Niere [12, 13]. Die häufigsten Nebenwirkungen sind Übelkeit (10% bzw. 9% der Patienten), Verdauungsstörungen (7 %) und erhöhte Transaminasewerte (6 % bzw. 8 %). In einer Studie mussten 3,6 % der Patienten in einer 10-Tage-Studie die Therapie aus letzterem Grund abbrechen. Allerdings können auch schwere Virusinfektionen Leberschäden verursachen. Die Trennung der beiden Ursachen stellt eine große Herausforderung dar. Außerdem ist Remdesivir kein Allheilmittel. In einer Studie verkürzte sich unter Remdesivir die Genesungszeit von 15 auf 11 Tage; bei Patienten mit leichter bis mittelschwerer Erkrankung zeigte es jedoch keine Wirkung und bei Patienten, die bereits beatmet wurden, konnte kein Unterschied in der mittleren Genesungszeit festgestellt werden [14]. Da das Medikament über mehrere Tage als Infusion verabreicht werden muss, gibt es ein ziemlich kleines Zeitfenster, in dem Remdesivir tatsächlich helfen kann. 

Wie auch Remdesivir hat Favipiravir seine eigenen Nebenwirkungen. Dazu zählen unter anderem Die Schädigung von Leber und Niere, erhöhte Harnsäurewerte, Hautallergien usw. [15]. Aus diesem Grund soll es bei Patienten mit schwerer Diabetes und schweren Herzerkrankungen nicht eingesetzt werden. Zudem ist es für schwangere Frauen nicht geeignet, da es Missbildungen oder ein Absterben des Fötus verursachen kann. Es hat sich gezeigt, dass Favipiravir nur im Anfangsstadium einer SARS-CoV-2-Infektion wirkt, wenn das körpereigene Immunsystem noch gut funktioniert. Bei schwer erkrankten Patienten kann es einen „Zytokinsturm“ auslösen (bei dem das Immunsystem lebensbedrohlich entgleist). Ein universelles Medikament gegen COVID-19 müsste aber für alle Menschen sicher sein. 

Diese Medikamente sind jedoch besser als nichts. Und indem Wissenschaftler die beteiligten Mechanismen verstehen lernen, können sie vorhandene Medikamente zum Nutzen aller weiter verbessern. Während die meisten an der RNA-Polymerase ansetzenden „allgemeinen Virostatika“ bei SARS-CoV-2 versagt haben, war Remdesivir hingegen manchmal erfolgreich. Die Wissenschaft vermutet, dass seine begrenzte Wirksamkeit an einem SARS-CoV-2-eigenen Korrekturprotein namens Exonuklease liegt. Sobald die RNA-Polymerase neue RNA gebildet hat, prüft die Exonuklease diese auf Richtigkeit. Eine Studie hat gezeigt, dass ein anderer RNA-simulierender Arzneistoff namens Ribivarin unmittelbar nach der RNA-Synthetisierung erkannt und anschließend durch die Exonuklease wieder aus der RNA entfernt wird. Die Reparaturmechanismen scheinen für Remdesivir jedoch nicht gut zu funktionieren, was erklärt, warum es erfolgreicher ist als andere Medikamente [17], [18].

Wie nsp14 die Integrität und Virulenz von SARS-CoV-2 aufrechterhält, lesen Sie in einem zukünftigen Blog-Eintrag!

Haben wir das nicht alles schon einmal erlebt? Bild von Alex Payne, Coronavirus Structural Task Force.

Abbildung 6. Haben wir das nicht alle schon erlebt?

Empfohlene Strukturen

Wer die Strukturen eingehender zu studieren möchte, findet diese in unserem GitHub-Repository, zusammen mit Informationen zur Validierung und, soweit vorhanden, zu verbesserten Strukturen. Für einen hochauflösenden Vergleich des aktiven Zentrums mit und ohne Remdesivir wurden 7BV2 bzw. 7BV1 zusammen bei 2,5 bzw. 2,8 Å Auflösung veröffentlicht. In der wachsenden Struktur des oben gezeigten Komplexes (6YYT) sind sowohl die Polymerase als auch die Kofaktoren und die RNA mit wenig „fehlender“ Dichte und einer Auflösung von 2,9 Å sehr gut aufgelöst. Sie ist wahrscheinlich 6M71 und 7BTF vorzuziehen, die mit einer ähnlichen Auflösung veröffentlicht wurden, wobei allerdings der Komplex weniger detailliert ist und keine RNA vorliegt. Für Interessierte: 7C2K und 7BZF (bei 2,93 Å und 3,26 Å) zeigen den an die RNA gebundenen Komplex vor und nach der Translokation.


Quellen

[1] J. S. Morse, T. Lalonde, S. Xu, and W. R. Liu, “Learning from the Past: Possible Urgent Prevention and Treatment Options for Severe Acute Respiratory Infections Caused by 2019-nCoV,” ChemBioChem, vol. 21, no. 5, pp. 730–738, Mar. 2020, doi: 10.1002/cbic.202000047.

[2] H. S. Hillen, G. Kokic, L. Farnung, C. Dienemann, D. Tegunov, and P. Cramer, “Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase,” Nature, May 2020, doi: 10.1038/s41586-020-2368-8.

[3] W. Yin et al., “Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir,” Science, p. eabc1560, May 2020, doi: 10.1126/science.abc1560.

[4] R. T. Eastman et al., “Remdesivir: A Review of Its Discovery and Development Leading to Emergency Use Authorization for Treatment of COVID-19,” ACS Cent. Sci., May 2020, doi: 10.1021/acscentsci.0c00489.

[5] O. of the Commissioner, “Coronavirus (COVID-19) Update: FDA Issues Emergency Use Authorization for Potential COVID-19 Treatment,” FDA, May 04, 2020. https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-issues-emergency-use-authorization-potential-covid-19-treatment (accessed Jul. 08, 2020).

[6] A. Sternlicht, “Japan Approves Remdesivir For Use On Severe COVID-19 Patients,” Forbes. https://www.forbes.com/sites/alexandrasternlicht/2020/05/07/japan-approves-remdesivir-for-use-on-severe-covid-19-patients/ (accessed Jul. 08, 2020).

[7] D. CZARSKA-THORLEY, “First COVID-19 treatment recommended for EU authorisation,” European Medicines Agency, Jun. 25, 2020. https://www.ema.europa.eu/en/news/first-covid-19-treatment-recommended-eu-authorisation (accessed Jul. 10, 2020).

[8] E. De Clercq, “New Nucleoside Analogues for the Treatment of Hemorrhagic Fever Virus Infections,” Chem. Asian J., vol. 14, no. 22, pp. 3962–3968, Nov. 2019, doi: 10.1002/asia.201900841.

[9] K. Shiraki and T. Daikoku, “Favipiravir, an anti-influenza drug against life-threatening RNA virus infections,” Pharmacol. Ther., vol. 209, p. 107512, May 2020, doi: 10.1016/j.pharmthera.2020.107512.

[10] T. Hornyak, “Japan sending Fujifilm’s flu drug favipiravir to over 40 countries for Covid-19 trials,” CNBC, May 04, 2020. https://www.cnbc.com/2020/05/04/fujifilms-flu-drug-favipiravir-sent-to-43-nations-for-covid-19-trials.html (accessed Jul. 14, 2020).

[11] G. P. Ltd, “Glenmark Becomes the First Pharmaceutical Company in India to Receive Regulatory Approval for Oral Antiviral Favipiravir, for the Treatment of Mild to Moderate COVID-19.” https://www.prnewswire.com/in/news-releases/glenmark-becomes-the-first-pharmaceutical-company-in-india-to-receive-regulatory-approval-for-oral-antiviral-favipiravir-for-the-treatment-of-mild-to-moderate-covid-19-855346546.html (accessed Jul. 14, 2020).

[12] Goldman, J. D. et al. Remdesivir for 5 or 10 Days in Patients with Severe Covid-19. N. Engl. J. Med. (2020) doi:10.1056/NEJMoa2015301

[13] Remdesivir Safety Forecast: Watch the Liver, Kidneys | MedPage Today. https://www.medpagetoday.com/infectiousdisease/covid19/86582

[14] J. H. Beigel et al., “Remdesivir for the Treatment of Covid-19 — Preliminary Report,” N. Engl. J. Med., vol. 0, no. 0, p. null, May 2020, doi: 10.1056/NEJMoa2007764.

[15] Sandhya Ramesh, “Favipiravir, Japanese drug that’s the new Covid treatment hope your chemist will soon stock,” ThePrint, Jun. 25, 2020. https://theprint.in/health/favipiravir-japanese-drug-thats-the-new-covid-treatment-hope-your-chemist-will-soon-stock/447987/ (accessed Jul. 14, 2020).

[16] F. Ferron et al., “Structural and molecular basis of mismatch correction and ribavirin excision from coronavirus RNA,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 115, no. 2, pp. E162–E171, Jan. 2018, doi: 10.1073/pnas.1718806115.

[17] C. J. Gordon, E. P. Tchesnokov, J. Y. Feng, D. P. Porter, and M. Gotte, “The antiviral compound remdesivir potently inhibits RNA-dependent RNA polymerase from Middle East respiratory syndrome coronavirus,” J. Biol. Chem., Feb. 2020, doi: 10.1074/jbc.AC120.013056.

[18] L. Zhang et al., “Role of 1’-Ribose Cyano Substitution for Remdesivir to Effectively Inhibit both Nucleotide Addition and Proofreading in SARS-CoV-2 Viral RNA Replication,” bioRxiv, p. 2020.04.27.063859, Apr. 2020, doi: 10.1101/2020.04.27.063859.

Das Coronavirus unkompliziert selbst drucken und zusammenbauen – wir haben ein 3D-Modell dafür entworfen!
Abhängig vom User und dem jeweiligen 3D-Drucker sind die Details natürlich unterschiedlich. Die Methoden, die wir angewandt habenkönnen aber als Anhaltspunkt dienen. Nutzer ohne eigenen 3D-Drucker können die STL-Daten aber auch dafür verwenden, den Druck bei einem externen Dienstleister zu beauftragen. Wir hoffen, mit diesem Projekt nicht nur private Nutzer zu erreichen, sondern auch bessere Möglichkeiten für die Lehre und das öffentliche Verständis des Virus zu schaffen.

Unser Entwurf basiert auf aktuellesten wissenschaftlichen Erkenntnissen bezüglich der Proteinstrukutur und Größenverhältnisse. Mehr dazu hier.

Mit dem ausgedruckten und zusammengebauten Modell bekommt man eine Vorstellung, wie das Virion aussehen würde, wenn es um eine Million vergrößert wäre (1 mm des Models stellt 1 nm (10 Å) dar). Die RNA, das Erbgut des Virus, wäre dann zehn Meter lang und einen Millimeter dick.

Zusätzlich haben wir ein Modell eines menschlichen Antikörpers im selben Maßstab entworfen, welches zusätzlich zu den Strukuren des Virions gedruckt und je nach Wunsch an das Spike-Protein angehägt werden kann. Um das Drucken, Bemalen und Zusammenbauen zu erleichtern, haben wir die Virusstruktur in vier einzelne Komponenten zerlegt:

Bis jetzt wurden die Strukturen erfolgreich auf verschiedenen Schmelzschicht-Druckern (FDM), einem Rostok MAX v2 und einem Prusa I3 MK3 Drucker getestet. Mit anderen Methoden, wie Stereolithographie, wäre eine noch höhere Qualität durchaus möglich.

Jeder Teil ist im STL-Format verfügbar und sollte mit jeder geeigneten Slicer-Software druckbar sein.

Beim Zusammenbauen und Bemalen des fertigen Drucks geht man am besten nach eigenem Gutdünken vor. Die exakten Details unterschieden sich schließlich je nach Equipment und nach den Einstellungen.
Wir zeigen hier trotzdem unseren Aufbau in knapper Zusammenfassung.

Druck der Komponenten:

Der erste Schritt ist das Drucken der einzelnen Bestandteile. Die Virion-Kugel ist schnell gedruckt, da durch die flache Oberfläche keine weiteren Träger oder Verbindungen benötigt werden.
Dieser Teil kann mit einem Minimum an Füllung und Trägern gedruckt werden, aus Gründen der Stabilität empfehlen wir jedoch eine Füllung von mindestens 10%.

Die anderen Teile (Spikeproteine und Antikörper) stellen hierbei eine größere Herausforderung dar.
Das Spikeprotein muss für das fertige Model mindestens 95mal gedruckt werden. Hierzu können entweder individuelle Einstellungen genutzt oder die 25x STL-Datei 4mal gedruckt werden.
Es ist empfehlenswert das Spike-Protein mit dem Kopf in Richtung Druckbett zu drucken. Das erhöht die Stabilität und benötigt weniger Verbindungen und Vernetzungen zwischen den einzelnen Trägern.
Diese müssten sonst mit Fingerspritzengefühl vom sensiblen Stamm der Spikes entfernt werden. Wie viele Träger zusätzlich hinzugefügt werden, kann je nach Nutzer und der jeweiligen Situation entschieden werden.

Ein Dual-Extruder-Drucker ist für das Herstellen der Spikes ideal, da die stabilisierenden Verbindungen zwischen den Spikes aus einem wasserlöslichen Plastik gedruckt und somit einfach zu entfernen sind. Auf jeden Fall erzeugt ein individueller Druck der Spikes oder zumindest eine geringere Anzahl pro Block ein besseres Ergebnis. Die Verarbeitung dieser Spikes ist dann einfacher, auch wenn der Druck zeitaufwändiger wird. Generell muss ein guter Kompromiss zwischen der Druckgenauigkeit, der Geschwindigkeit und dem Aufwand beim Aufarbeiten der Modelle gefunden werden.

Die Details dieses Prozesses hängen vor allem von der Art des Druckers, dem Aufbau und der Drucktechnik ab. Wir nutzten die bekannteste Technik: Schmelzschicht-Druck (FDM), als Plastik wurde Polylactide (PLA) verwendet, was die folgende Aufreinigung erleichterte.

Aufarbeitung

Um die Objekte möglichst sauber zusammensetzen und bemalen zu können, ist eine Aufarbeitung der Einzelteile notwendig. Die Stabilisierungsstücke können mit einer Zange entfernt werden, während kleinere Artefakte einen Abschliff benötigen. Auch ein Zahnstocher hat sich als hilfreich erwiesen.

Links die Virion- und Spike-Protein- Oberflächen nach dem Druck, mit erkennbaren Artefakten und Plastik-Fadenbildung . Auf der rechten Seite das mit Ethylacetat behandelte Virion mit einer glatten Oberfläche. Bilder von Ferdinand Kirsten, Matt Reeves.
Links die Virion- und Spike-Protein- Oberflächen nach dem Druck, mit erkennbaren Artefakten und Plastik-Fadenbildung . Auf der rechten Seite das mit Ethylacetat behandelte Virion mit einer glatten Oberfläche. Bilder von Ferdinand Kirsten, Matt Reeves.

Für PLA erwies sich Ethylacetat als die beste Reinigungsmethode um Oberflächen zu glätten und Überbleibsel der Träger zu entfernen. Das Ethylacetat löst das Plastik auf und zerstört somit kleine Unebenheiten auf den Oberflächen, wenn es bedacht angewendet wird. Hierbei kann unterschiedlich vorgegangen werden, wobei die schonendste Methode das Aussetzen in eine Ethylacetat-Dampf Umgebung in einem geschlossenen Gefäß ist. Es entsteht eine glatte Oberfläche mit genauen Details, der Prozess nimmt jedoch oft viele Stunden oder sogar einige Tage in Anspruch.

Die schnellere Methode , die ebenfalls zufriedenstellende Resultate liefert, ist das Eintunken der Objekte in Ethylacetat für 10-30 Sekunden. Anschließend werden sie abgetupft und zum Trocknen ausgelegt. Oft ist ein zweiter Reinigungsgang nötig. Für die größeren Virusteile kann es helfen ein Tuch, welches mit Ethylacetat getränkt ist, bis zum gewünschten Ergebnis über die Oberfläche zu reiben. Mit dieser Methode lassen sich die beiden Virionhälften auch hervorragend zusammenkleben. Eine kleine Menge Ethylacetat wird auf jeder Fläche der Hälften verteilt und die Hälften zusammengedrückt, bis sie zu einem einzigen Stück verschmolzen sind. Auch die Naht kann dann mit einem Ethylacetat-Tuch gut geglättet werden. Hierfür stellt Aceton-freier Nagellackentferner eine ausgezeichnete, frei käufliche Alternative dar, die die gleichen Ergebnisse erzielen dürfte. Bei der Handhabung dieser Chemikalien sollte immer geeignete Schutzausrüstung getragen werden ( Schutzbrille, Handschuhe etc.).

Spike-Proteine Frisch nach dem Druck (links) und nach der Aufarbeitung mit Ethylacetat (rechts), Bild von Ferdinand Kirsten.
Spike-Proteine frisch nach dem Druck (links) und nach der Aufarbeitung mit Ethylacetat (rechts), Bild von Ferdinand Kirsten.

Übrigens: Aceton erzielt für das andere häufig genutzte Druckmaterial, Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) die gleiche Wirkung wie Ethylacetat für PLA.

Bemalen und Zusammensetzen

Wie beim Druck, sind auch das Bemalen und die jeweiligen Malmethoden dem Nutzer individuell überlassen. Hier zeigen wir die Variante des Würzburger Modells, bei der wir versucht haben, der Illustration von Thomas Splettstösser möglichst treu zu bleiben.

Am Computer erstelltes Bild des Virusses von Thomas Splettstoesser (links) und das ferige 3D-Modell des Thorn Labs (rechts).
Am Computer erstelltes Bild des Virusses von Thomas Splettstoesser (links) und das ferige 3D-Modell des Thorn Labs (rechts).

Die Einzelteile wurden zu Beginn mit einem Primer überzogen, um die Farbe besser an das Modell zu binden. Außerdem wirkt dieser wie eine gleichmäßige Grundierung. Beim Auftragen des Primers und der Nutzung einer Airbrush muss auf die Sicherheit geachtet werden, um das Einatmen der schädlichen Substanzen zu vermeiden. Ein gut belüfteter Raum, ein Abzug und eine Zirkulation weg vom Körper sind zu empfehlen. Das Tragen von Handschuhen, einer Schutzbrille und einer Maske sollte für zusätzlichen Schutz sorgen.

In unserem Fall wurde das Modell hauptsächlich mit einer Airbrush bemalt und wir empfehlen diese Methode für die kleinen Oberflächendetails und komplexen Strukturen. Natürlich können auch alle Teile mit dem Pinsel angemalt werden, dies ist jedoch deutlich zeitaufwendiger und erfordert genaueres Arbeiten. Alle genutzen Farben, Verdünner, Primer und Lack sind von Citadel-Painting. Hier eine Liste der genutzten Farben und Amterisleien die für unser Modell verwendet wurden:

  • Grün: “Moot green”
  • Gelb: “Yriel Yellow”
  • Grau: “Dawnstone”
  • Braun: “Baneblade Brown”
  • Dunkelbraun: “Doombull Brown”
  • Hellblau (Aqua): “Gauss Blaster Green”
  • Türkis: “Kabalite Green”
Die Spike-Proteine Sortiert nach Farben (links oben), nur mit Grundierung (links unten) und nach dem Hervorheben mit Limettengrün (rechts). Bild von Kristopher Nolte.
Die Spike-Proteine Sortiert nach Farben (links oben), nur mit Grundierung (links unten) und nach dem Hervorheben mit Limettengrün (rechts). Bild von Kristopher Nolte.

Um den Effekt einer natürlichen Lichtquelle zu erzeugen wurden die Spikes in vier Gruppen unterteilt und unterschiedlich hell bemalt.
Wenn das Modell nicht für die feste Ausstellung auf einer Halterung oder Ähnlichem geplant ist, ist dieser Schritt nicht notwendig. Jedes Spike-Protein wurde mit einem helleren Limettengrün hervorgehoben (Highlighting), um einen stärkeren Kontrast zu erzeugen und die Oberfläche besser zu differenzieren. Anschließend wurde das Highlighting mit einem "Dry-brush" der hellblauen (Aqua) Farbe vollendet.

Virion-Kugel (oder auch liebevoll Kartoffel genannt) mit hervorgehobenen Hüllenproteinen (links) und nach der Grundierung (rechts). Bild von Kristopher Nolte.
Virion-Kugel (oder auch liebevoll Kartoffel genannt) mit hervorgehobenen Hüllenproteinen (links) und nach der Grundierung (rechts). Bild von Kristopher Nolte.

Nachdem das Virusmodell samt Spikes bemalt war, wurde die Farbe mit Glanzlack und einem matten Finish versiegelt. Dieser Schritt ist ebenfalls optional, aber zum Schutz gegen Abnutzung der Farben bei häufiger Handhabung des Modells zu empfehlen.

Nach all diesen Schritten kommt es endlich zum langersehnten Zusammensetzen der Einzelteile. Falls die Spike Proteine verschiedene Highlights bekommen haben, ist darauf zu achten, sich auf eine „Lichtquelle“ festzulegen und die Spikes dementsprechend anzuordnen und am Modell zu befestigen (Auf einem Ständer: Unten dunkler, nach oben heller). Um die Spikes an ihrer Position zu befestigen haben wir normalen Modellbaukleber verwendet. Starker Bastel-Kleber oder Ethylacetat können hierfür ebenfalls benutzt werden, sowie kleine Magnete für besondere Tüftlerinnen und Tüftler. Da unser Modell auf einer Halterung präsentiert werden soll, wurde hierfür ein Loch an der Unterseite des Modells freigelassen, in dem dann die Stange befestigt werden kann.

Zusammensetzen des Modells mit Kleber. Die Spike-Proteine werden in den dafür vorgesehenen Löchern befestigt. Bild von Kristopher Nolte.
Zusammensetzen des Modells mit Kleber. Die Spike-Proteine werden in den dafür vorgesehenen Löchern befestigt. Bild von Kristopher Nolte.

Hoffentlich hat euch unser kleines Abenteuer gefallen und inspiriert, euch an euer eigenes 3D-Coronamodell zu wagen. Die beschriebenen Arbeitsschritte haben insgesamt etwas mehr als eine Woche in Anspruch genommen. Das Drucken dauert etwa einen Tag.  Aufreinigung und Verfeinerung benötigten mehr als zwei Tage und das Bemalen des Modells ein ganzes Wochenende.

Die Dateien sind öffentlich auf Thingiverse verfügbar und das Modell ist lizensiert als Creative Commons BY-NC: Frei Verwendung und Veränderung für nicht-kommerzielle Zwecke und unter Nennung der "Coronavirus Structural Task Force" als Urheber.

3D-Druck Illustration von Thomas Splettstoesser (links) im Vergleich mit dem Modell von Dale Tonrud aus Oregon (mitte) und dem Thorn Lab aus Würzburg (rechts).
3D-Druck Illustration von Thomas Splettstösser (links) im Vergleich mit dem Modell von Dale Tonrud aus Oregon (mitte) und dem Thorn Lab aus Würzburg (rechts).

Wie bei jedem 3D-Modell, gibt es weit mehr als einen Weg, diese Aufgabe anzugehen und zu vollenden. Wir freuen uns, darauf, Eure Modelle zu sehen und mit Euch über Herangehensweisen und Techniken zu diskutieren - hier in den Kommentaren, auf Thingiverse oder Twitter!

Die Autoren:

Wir möchten hervorheben, dass dieser Artikel eine Zusammenarbeit mehrerer Leute ist:

Dale Tonrud und Thomas Splettstösser haben zusammen die STL Dateien für das 3D Modell erstellt und verfeinert. dale hatte die Idee, ein Modell zu drucken und diese wurde dann von Andrea Thorn aufgegriffen. Thomas und Dale sorgten dann dafür, das Modell möglichst realistisch und gleichzeitig gut für Handhabung und Druck in Einzelteilen zu gestalten. Dale druckte das erste Design des Modells aus.
Matt Reeves war für die Optimierung und den Druck des Würzburger Modells zuständig. Er fand heraus, wie das Modell am besten nachbearbeitet wird und trug zusammen mit dem Rest des Teams zur Verbessung des Modells bei.
Kristopher Nolte arbeitete zusammen mit Ferdinand Kirsten das gedruckte Modell auf und reinigte es. Kristopher war zudem für die filigrane Arbeit des Bemalens und Zusammensetzens des fertigen Virions verantwortlich.

Dieser Artikel ist übersetzt von Ferdinand Kirsten, Pairoh Seeliger und Kristopher Nolte, nach dem originalen Artikel in Englisch von Kristopher Nolte, Dale Tonrud und Matt Reeves.

Das Coronavirus ist unsichtbar; man kann es mit bloßem Auge nicht sehen - und das ist ein großes Problem.
Wenn ein Haus lichterloh in Flammen steht, dann erkennen wir die Gefahr sehr leicht. Wir würden sofort reagieren: Das Haus verlassen, die Feuerwehr rufen und die Nachbarn warnen. Beim Coronavirus ist die Gefahr leider nicht so klar erkennbar; man kann SARS-CoV-2 weder sehen noch anfassen. Zwischen Infektion und der Erkrankung vergehen einige Tage (1) und dann im Mittel noch einmal 16 Tage bis zum Tod - im schlimmsten Fall (2).
Stell dir eine Katastrophe vor, die in New York City 32.362 Menschen tötet. Genau diese Zahl – ein Toter pro 250 Einwohnern – ist in den letzten Monaten in New York an COVID-19 gestorben (3). Die Unsichtbarkeit, Ungreifbarkeit der Bedrohung macht es schwierig, die Gefahr richtig einzuschätzen und entsprechende Schutzmassnahmen zu ergreifen: Masken zu tragen und Abstand zu halten. Es ist schwer, sich einer unsichtbaren Bedrohung bewusst zu werden und noch schwieriger, wenn man die Bedrohung nicht versteht.

Deswegen wollen wir, dass Menschen das Virus sehen, oder noch besser: Es anfassen können - und dafür haben wir ein dem aktuellen Wissenstand entsprechendes 3D-Modell entworfen.
Und das Beste daran: Wir stellen die Druckdateien kostenfrei zur Verfügung, weil unsere Arbeit mit öffentlichen Geldern finanziert wird. (Bei Verwendung der Druckdateien bitten wir um einen Hinweis auf die Coronavirus Structural Task Force als Urheber.)

3D printed corona vrisu model
Das gedruckte und bemalte 3D-Modell. (Photo: Judith Flurer / RVZ.)

Unser Modell sieht anders aus als die Coronaviren aus den Medien. Warum?

Zunächst einmal gilt zurzeit einfach jeder beliebiger Stachelball in den Medien als Coronavirus. Aber „unser“ Virus unterscheidet sich aber auch von der Illustration des CDC, die von den beiden medizinischen Illustratoren Alissa Eckert und Dan Higgins erschaffen wurde. Die Hauptunterschiede zwischen deren rot-grauen Darstellung und unserer sind:

  • Der Virus ist nicht wirklich rund, eher etwas wobbelig. Das zeigt unser 3D-Druck auch.
  • Die Anzahl der E-Proteine (orange), M-Proteine (gelb) und Stacheln (grün) stimmt mit den neuesten Erkenntnissen überein. (4)
  • Die Stacheln sind länger als in der CDC-Abbildung, weil wir jetzt mehr über die Struktur des Virus wissen
  • Die Virushülle ist im Vergleich zu den Stacheln kleiner. Die Größe variiert und die Größe unseres Modells ist ein Durchschnittswert.
  • Die Stacheln sind glykolisiert, und dadurch werden sie unregelmäßiger (und schleimiger). Die Glykosilierung ist in der Animation (unten) grau abgebildet. Das könnte man am Modell mit Watte darstellen, die man an den Stacheln anbringen könnte.
  • Wir zeigen das E-Protein (gelb) als fünfzähligen Pore. Ob das eine korrekte Annahme ist, bleibt abzuwarten. Wenn du darüber mehr erfahren möchtest, siehe hier.
  • Wir haben uns für eine Farbgebung entschieden, die der schleimigen, feuchten Umgebung entspricht, in der das Virus Wirtszellen befällt. (Die rote und graue Farbwahl des CDC zielt darauf ab, die Bedrohung zu verdeutlichen, die das Virus darstellt. (5)
Merge of two virus representations
Vergleich zwischen unserer Darstellung (Thomas Splettstößer / SciStyle.com) und der in den Medien häufig verwendeten Illustration dec CDC.

Wir haben auch ein Rhinovirus und einen Antikörper im selben Maßstab in den Dateien hochgeladen. Der Antikörper bindet spezifisch an den Stachel. Auf diese Weise erkennt das Immunsystem den Virus – und am Rhinovirus kann man gut erkennen, wie groß SARS-CoV-2 im Vergleich zu anderen Viren ist. Eigentlich sollte man es "Viruspartikel" nennen, denn es handelt sich dabei nur um die Transportform des Virus, mit der es verbreitet wird. Wenn es eine Wirtszelle befällt, werden aus dem im Virion enthaltenen Erbgut viele weitere Moleküle produziert, die die Wirtzelle in ihrem Sinn ez ueiner Virusfabrik umbauen - diese Proteine sind auch ein Teil des Virus, und ein wichtiger Bestandteil unserer Forschung.

Erstelle Dein eigenes 3D Modell! Hier kannst du die Dateien und die Anleitung zum 3D Druck und der Gestaltung finden!

Quellen:

(1) Rothan Hussin A., and Byrareddy Siddappa N. "The epidemiology and pathogenesis of coronavirus disease (COVID-19) outbreak." Journal of autoimmunity (2020): 102433. pmid:32113704

(2) https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/26/7/20-0282_article

(3) 32.362 deaths by 31th of July 2020 as reported by the New York Times in 8.4 million inhabitants (US Census Bureau) gives 0,39 %, roughly equalling 1 in 250.

(4) https://www.nytimes.com/2020/04/01/health/coronavirus-illustration-cdc.html

Proteine sind komplexe und empfindliche, große Moleküle (sogenannte Makromoleküle), deren Strukturanalyse uns sehr viel über ihre Funktion verraten kann. Doch die Messung ist komplizierter als man annehmen mag. Man kann nicht einfach einen Blick durch ein Mikroskop werfen, fokussieren und das Protein sehen. Man kann es sich wie das Röntgenbild eines Arms vorstellen, mit dem kleinen Unterschied, dass der Arm hierfür abgenommen, tausendfach vervielfältigt und kristallisiert werden müsste, bevor er mit Röntgenstrahlen beschossen wird. Nachdem man sich dann noch mit viel Mathematik herumgeschlagen hat, würde man so das fertige Bild eines Arms erhalten.

Unterschiedliche Methoden

Die experimentell ermittelten Molekülstrukturen aus dem Coronavirus können aus drei Quellen stammen: Röntgenkristallographie, Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) oder Kernspinresonanz in Lösung (NMR). Jede dieser Methoden bringt dabei ihre ganz eigenen Vor- und Nachteile mit sich. Kombiniert man diese Methoden miteinander und mit weiteren Techniken wie Massenspektrometrie, chemischer Quervernetzung, fluoreszentem Resonanzenergietransfer und einigen Berechnungen, können die genauen Details der Molekülstruktur Stück für Stück ans Licht gebracht werden.

Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)

Wenn es darum geht, eine „große“ (aber immer noch sehr kleine) Molekülstruktur aufzulösen, kann die Elektronenmikroskopie einem einen ausgezeichneten strukturellen Überblick bieten. Im Gegensatz zu den anderen Techniken wird das Molekül direkt abgebildet. Das geschieht mit Hilfe eines Elektronenstrahls und eines Systems von Linsen. Der schwierige Teil ist dann die Umwandlung dieser 2D-Abbildungen in dreidimensionale Strukturen. Dafür bildet man das Objekt tausende Male aus verschiedenen Perspektiven ab, um es dann dreidimensional rekonstruieren zu können. Auch wenn Elektronenmikroskopie lange Zeit als Methode mit niedriger Auflösung galt, ermöglicht moderne Technologie eine immer höhere Auflösung, die fast den Detailreichtum der Röntgenkristallographie erreichen kann. Es können sogar Aminosäure-Seitenketten, Wassermoleküle auf den Oberflächen der Makromoleküle und Liganden erkannt werden.

Entstehung einer Kryo-EM Struktur. Ein Bild von tausenden verschiedenen Ansichten der Makromoleküle (A) und die 16 am häufigsten auftretenden in (B). Die fertige 3.3 Angstöm Struktur-Karte in (C). 
Original Bilder von: Matthies, D., Bae, C., Toombes, G.E., Fox, T., Bartesaghi, A., Subramaniam, S., Swartz, K.J. (2018) Life 2018;7:e37558, bearbeitet von  Ferdinand Kirsten, Lizenz: CC BY-ND 2.0
Entstehung einer Kryo-EM Struktur. Ein Bild von tausenden verschiedenen Ansichten der Makromoleküle (A) und die 16 am häufigsten auftretenden Ansichten in (B). Die fertige 3.3 Ångstöm Struktur-Karte in (C).
Original Bilder aus: Matthies, D., Bae, C., Toombes, G.E., Fox, T., Bartesaghi, A., Subramaniam, S., Swartz, K.J. (2018) Life 2018;7:e37558, bearbeitet von Ferdinand Kirsten, Lizenz: CC BY-ND 2.0

NMR-Spektroskopie

Ein wichtiger Teil der NMR-Spektroskopie ist die sogenannte Isotopenanreicherung. Während beim altbekannten MRT beim Arzt lediglich die Position der Atomkerne eines bestimmten Gewebes bestimmt werden kann, gestattet diese Methode eine genauere Analyse der Verteilung der Kohlenstoffatome. Dazu müssen sich die Kohlenstoffatome jedoch voneinander unterscheiden: Deshalb werden im Laufe des Aufarbeitungsprozesses verschiedene Isotope mit unterschiedlicher Neutronenzahl im Kern in das Proteinrückgrat eingebaut. Nach dieser Aufarbeitung wird das Protein einem starken Magnetfeld ausgesetzt und mit Radiowellen gemessen. Die entstehenden spezifischen Resonanzen jeder Substanz werden dann analysiert und man erhält Informationen über die Position jedes Kohlenstoff-Atomkerns im Verhältnis zu den anderen. Durch diese Positionsbestimmung kann man auf Distanzen oder mögliche chemische Bindungen schließen. Jetzt gilt es, das sudokuartige Rätsel richtig zu lösen, um ein atomares Modell des Moleküls erstellen zu können. Diese Methode eignet sich nur für kleine oder mittelgroße Moleküle, da größere Strukturen zu viel Überlappung in den Resonanzspektren verursachen. Die NMR-Spektroskopie kann jedoch damit punkten, dass die Messung flexibler Proteine in Lösung möglich ist. Sie ist an kein festes Stadium gebunden, das molekulare Bewegungen einschränken würde.

Darstellung eines Daten-Sets, dass aus NMR-Spektroskopie gewonnen wurde. Einige der Einschränkungen, die hier bei der Strukturlösung von Hemoglobin sind hier in gelb dargetsellt, das Protein in grün. (PDB: 1vre und 1vrf). Bild von PDB101.rcsb.org.
Darstellung eines Datensets, dass aus NMR-Spektroskopie gewonnen wurde. Das Protein ist in Grün dargestellt, die bekannten Abstände zwischen Kohlenstoffen sind gelb (PDB: 1vre und 1vrf). Bild von PDB101.rcsb.org.

Röntgenkristallographie

Die Röntgenkristallographie ist, von den hier behandelten Methoden, die am häufigsten genutzte. Insgesamt sind 145252 der Strukturen in der Protein-Datenbank mittels Röntgen-Kristallographie gemessen worden. Die NMR-Spektroskopie (12965 Strukturen) und die Kryo-Elektronenmikroskope (4926 Strukturen) sind weitaus seltener vertreten. Das große Manko der Röntgenkristallographie ist die Notwendigkeit eines Proteinkristalls, aber sie liefert enormen Detailreichtum. Mit ihr kann man die Atome jeder Aminosäure und sogar von Liganden, Inhibitoren, Ionen oder anderen Molekülen bestimmen. Gleichzeitig schränkt aber der aufwändige Prozess der Kristallisation die Möglichkeiten ein, welche Proteine gemessen werden können. Die Aufarbeitung der Proteine für die Kristallisation bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe. Nach der Aufarbeitung kann die Produktion eines messbaren Proteinkristalls einige Zeit, mitunter Jahre, in Anspruch nehmen. Ein besonderes Problem stellen dabei sehr flexible Proteine dar. Als Enzyme oder Rezeptoren besitzen Proteine häufig bewegbare Teile oder liegen in verschiedenen Konformationen vor, um vollständig funktionsfähig zu sein. Genau diese flexiblen Proteine sind leider oft die Interessantesten.
Ist der Kristall einmal hergestellt, wird er mit flüssigem Stickstoff gekühlt und mit einem intensiven Röntgenstrahl beschossen. Dieser Prozess ist vergleichbar mit einem Kristall, der ins Licht gehalten wird. Er wirft Reflektionen an eine Wand und diese werden dann angesehen. Die Röntgenstrahlen treffen den Kristall und werden in einem spezifischen Muster reflektiert. Diese Reflektionen sind kein direktes Bild des Kristalles, sondern müssen erst richtig interpretiert werden, um daraus auf die Kristallstruktur, also die molekulare Struktur im Kristall, schließen zu können. Die Verteilung der Elektronen kann aus den Reflektionen errechnet werden und liefert eine Elektronen-Dichtekarte, mit der die Position jedes einzelnen Atoms abgeschätzt werden kann.

Schematische Vorgehensweise bei der Röntgenkristallographie. Das kristallisierte Protein streut den Röntgenstrahl in einem spezifischen Muster. Dieses Muster wird über spezielle Algorithmen in eine Elektronen-Dichtekarte mit der Aufenthaltswahrscheinlichkeit jedes Atomes umgerechnet. Daraus kann dann ein Modell der Struktur gebaut werden.
Kristalle von Andrea Thorn, Diffraktionsmuster von Sabrina Stäb, Grafik von Ferdinand Kirsten.

Und dann...?

Die molekularen Modelle, die aus diesen Methoden gewonnen werden, eröffnen zahlreiche Möglichkeiten: Struktur-basiertes-Wirkstoffdesign, computerbasierte, dynamische Simulationen und natürlich Antworten auf wichtige biologische Fragen. Aber wie interpretieren wir diese Strukturen richtig, um alle biologischen Informationen zu bekommen? Das wird das Thema des nächsten Blog-Eintrags!

Zum Nachlesen (Englisch):

Früher wurden Arzneimittel zufällig gefunden, und manchmal ist das auch heute noch so. Aber in diesem Artikel geht es um sogenanntes rationales Arzneimitteldesign. Wir fangen an mit zwei wichtigen Begriffen:

Wirkstoffe und Targets

Die meisten Arzneimittel sind kleinere Moleküle mit bis zu 70 Atomen. Diese Wirkstoffe binden im Körper an das sogenannte Target, ein „Makromolekül“. Makromoleküle können Eiweißstoffe, DNA, RNA und Zuckerketten (Kohlenhydrate) sein. Die allermeisten Targets sind Eiweißstoffe – Proteine.

Proteine sind die Arbeitstiere unseres Körpers – sie zerlegen die Moleküle in unserer Nahrung, ermöglichen die Zellteilung, aus ihnen bestehen Muskeln und Haare. Ein Grund, warum unsere Ernährung Protein enthalten muss, ist, weil unser Körper dieses in seine Bausteine zerlegt und daraus neue Proteine bauen kann. Sie sind absolut essentiell für unser Überleben.

Ein Beispiel: So wirkt Aspirin

Aber nicht nur unser Körper hat Proteine, auch Krankheitserreger wie Bakterien oder Viren (sic). Und nicht alle Proteine sind gut: Bei Stoffwechselstörungen oder chronischen Krankheiten kann es sinnvoll sein, die Aktivität bestimmter Proteine zu vermindern. Ein gutes Beispiel hierfür ist Cyclooxygenase-II oder kurz COX. Dieses Protein wird bei Verletzung von Zellen und bei Entzündung im Körper gebildet und katalysiert einen wichtigen Schritt bei der Herstellung von Schmerzbotenstoffen, so genannten Prostaglandinen. Ohne dieses Cyclooxygenase-II können keine Schmerzbotenstoffe hergestellt werden.

Acetylsalicylsäure - auch bekannt als ASS oder Aspirin – bindet an Cyclooxygenase-II und macht diese kaputt (siehe Bild). Das führt dazu, dass keine Schmerzbotenstoffe mehr gebildet werden, und man weniger Schmerzen empfindet*. In diesem Fall ist also Cyclooxygenase-II das Target und ASS der Wirkstoff.

Hemmung von COX durch Aspirin
Links: Cyclooxygenase-II, ein Eiweißstoff, der Schmerzbotenstoffe herstellt. Rechts: Acetylierung (4 rote Atome) durch Acetylsalicylsäure, auch genannt Aspirin. Diese blockiert den Kanal und das katalytische Zentrum, so dass Cyclooxygenase keine Schmerzbotenstoffe mehr herstellen kann. Die Wirkung hört erst auf, wenn der Körper neue Cyclooxygenase-II hergestellt hat (also einige Stunden). Bild von Andrea Thorn.

Arzneimittelentwicklung

Zur Arzneimittelentwicklung werden zwei Hauptmethoden eingesetzt:

Indirektes oder Liganden-basiertes Wirkstoffdesign testet Moleküle, die bereits bekannten Arzneimitteln in Ladung und Gestalt ähnlich sind. Diese werden darauf getestet, ob sie an das Target binden und es hemmen.

Direktes oder Struktur-basiertes Wirkstoffdesign beruht auf der Kenntnis des Targets und der Wirkstoff wird so ausgewählt, dass er an das Target bindet. Beim Fragment-basierten Wirkstoffdesign werden kleinere Moleküle an verschiedene Stellen im Target gebunden und mit diesem Wissen dann ein Wirkstoff synthetisiert, der die Eigenschaften der Fragmente in  einem Molekül vereint.

Für beide Hauptmethoden kann eine Vorauswahl von möglichen Wirkstoffen mithilfe von Computerberechnungen getroffen werden, aber für Struktur-basiertes Wirkstoffdesign muss die Struktur des Makromoleküls genau bekannt sein.

Die Coronavirus Structural Task Force hilft bei der Suche nach einem Arzneimittel, indem wir die makromolekularen Strukturen von möglichen Targets, nämlich den Proteinen des Coronavirus, überprüfen und zum Teil sogar verbessern. Außerdem bieten wir Wirkstoffdesignern Informationen zu den verschiedenen Makromolekülen an. Auf diese Art und Weise hoffen wir, einen Beitrag zur Bekämpfung des Virus zu leisten.

*Leider werden statt Prostaglandinen dann mehr Leukotriene produziert, die bei Asthmatikern einen Anfall auslösen können – deswegen sollen Asthmatiker Aspirin nur nach Absprache mit dem Arzt nehmen.

(Titelbild: Aspirintabletten von Ragesoss, Wikimedia Commons / license: CC 4.0)

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