Coronavirus
Structural Task Force

Spike Glycoprotein: Corona’s Key for Invasion

Für diesen Beitrag exisitiert leider keine deutsche Übersetzung.

COVID-19 is caused by the new coronavirus SARS-CoV-2. This virus has a characteristic virus hull featuring surface proteins which are commonly called “spikes”. Protruding from the viral hull like “spikes of a crown”, they give the coronavirus its name (corona = crown).  These proteins make the first contact with human cells and are akin to keys that use a human receptor called “angiotensin-converting enzyme2” (ACE2) as a backdoor to gain access to and infect the cell.

SARS-COV2 Animated picture. Realistic surface and spike proteins with glycosylation. Image: Thomas Splettstoesser; www.scistyle.com
Fig. 1. SARS-COV2 Animated picture. Numerous spike proteins, coloured in green, protrude from the virus hull which is coloured in brown. Spikes enable the coronavirus to invade human epithelial cells. Image: Thomas Splettstoesser; www.scistyle.com

1. Fuction of ACE2

ACE2 is a membrane protein which is anchored in the human cell membrane of epithelial cells. This type of cells can be found on the surface of lung, intestine, heart and kidney tissue. As a type I membrane protein, its primary function is to take part in maturation of angiotensin, a peptide hormone which controls vasoconstriction and blood pressure. ACE2 can be compared to a lock which can be unlocked by the coronavirus spike protein. The virus can then enter the cell and hijack its functions to reproduce itself, thus causing the Covid-19 infection which poses a serious danger to humanity, especially for older people and people with pre-existing conditions. For this reason, one approach to combating SARS-CoV-2 is to target and inhibit the spike to prevent infection. In order to do so, knowledge of the structural features of the spike and its interaction processes with ACE2 are indispensable. (Further information about how macromolecular structures are visualized can be found on our homepage: https://insidecorona.net/visualizing-macromolecular-structures/)

2. Spike: Structure and Fusion Mechanism

Fig. 2. Image of a spike protein (green) protruding out of the viral envelope (brown). This image shows the structure of a spike protein divided into several subdomains. Each subdomain comprises a specific function necessary for binding and fusion. The transmembrane domain anchors the spike protein in the virus membrane.  Heptat repeat 1, 2 and the fusion peptide play key roles in mediation of the fusion process and with the RBD domain, the virus makes contact to human cells. Note that only “stumps” of carbohydrate chains are shown. Image: Thomas Splettstoesser; www.scistyle.com

The Spike protein has a trimeric shape comprising three identical monomeric structural elements. Each of these monomers can fold out akin to a modern car key with a fold-out key element with specific teeth on its surface. This fold-out key element is the so-called “receptor binding domain” (RBD). The spike can only interact with ACE2 when its RBD is in a folded-out position, exposing its teeth, or  “receptor binding motive” (RBM). As the name suggests, it comprises a motive of different amino acids which then can bind and unlock the ACE2 receptor. This key lock mechanism triggers a cascade of events initiating fusion with the host cell. First, protein scissors are recruited to the binding site. These scissors (furin & transmembrane serine protease 2) cleave the spike protein for subsequent activation. The active spike molecule then rearranges itself to form a long structural “hook” (formed of HR1/ HR2 and FP see Fig.2) that brings the epithelial cell and viral cell membrane into close proximity for fusion. Once the fusion is completed, the path for the virus is clear to transfer its genome encoded in ribonucleic acid (RNA) into the host cell. This successful transfer then enables the virus to multiply itself and finally spread from cell to cell, causeing Covid-19 in its wake.

Fig. 3. This image shows a spike protein in complex with the human ACE2 receptor. (PDB:6vsb/6lzg). Left: The structure of a spike protein coloured in orange in complex with the human ACE2 receptor coloured in light orange. The white box shows the interaction site which is shown enlarged in the image ion the right. Right: The interaction site between spike and ACE2. Spike's "receptor binding domain (RBD)" includes a "receptor binding motif (RBM)" whose amino acids interact with those of the human receptor through hydrophilic interactions. These amino acids are shown as sticks protruding from the RBM and ACE2. Image: Sabrina Stäb

3. Evading the Immune System with Carbohydrate Chains

The human immune system normally recognizes the surface proteins of foreign organisms such as viruses or bacteria and reacts with an immune response to combat them. Spike proteins are such surface proteins but because of structural peculiarities, the coronavirus evades both the innate and the adaptive human immune system. The secret of these structural peculiarities are the N-glycans. These are long carbohydrate chains which sit on spike’s surface.  Each spike comprises 66 N-glycans forming a protective shield around the protein. Hence the human immune system has problems recognizing spikes and identifying the coronavirus as an enemy.

Fig. 5. Ribbon diagrams of a spike trimer with N-glycans on its surface coloured in cyan (PDB: 6vxx). In Image a, the spike protein is shown sideways and in b, the trimer can be seen from above. Unfortunately, both X-ray crystallography and cryo-EM cannot resolve long carbohydrate chains, so the structures of the chains shown in Figure 4 contain a maximum of three sugar monomers, while in most cases, the carbohydrate chains are much longer, covering most of the contact surfaces of the upper spike protein. Image: Sabrina Stäb

The COVID 19 pandemic has a massive impact on our lives, our health and the global economy. Scientists around the world are trying to develop new drugs to combat the virus. Since the spike plays a critical role in the infection process, it is a prime target for drug development against the pandemic.  One drug approach to inhibit the interaction between spike and the ACE2 receptor is to cap the spike protein using antibodies. Antibodies are proteins, normally produced by the human immune system to fight viruses. The idea is to treat patients with antibodies that cap the RBD of spike, thus preventing interactions with ACE2. This would lead to a nonfunctional spike, blocking the coronavirus from entering the cell (The key would no longer fit the lock). Another approach includes the development of small molecules that target and inactivate the protein scissor transmembrane serine protease 2 (see chapter 2), as the spike’s functionality depends on its cleavage activity. Since the spike protein decorates the virus hull, it could even be part of a potential vaccine. For this reason,  the spike protein could also become the key in the molecular fight against COVID-19.

Für diesen Beitrag steht leider keine deutsche Übersetzung zur Verfügung.

Introduction

Have you heard that the coronavirus “mutates”? Or that there are “several strains” of it around the world? Sounds scary, right? However, the reality is that everything “mutates”. All organisms, over time, acquire differences in their genes, from bacteria to humans. You might be aware that this can happen when your DNA (Deoxyribonucleic Acid) is exposed to UV light (like from the sun!), but this can also happen during DNA replication. This is when a cell uses the template of one of the two DNA strands to make a new complimentary copy of the other strand. Mutation is common to all living organisms (and viruses) and a driver of evolution. This is the first post in a series that will explore coronavirus replication with a focus on the proteins involved. 

How does the coronavirus make more of itself?

SARS-CoV-2 uses single-strand Ribonucleic acid (RNA) to encode its genome, not DNA, and hence belongs to a class of “single-strand RNA viruses”. For this reason, the virus needs a different way to copy its genome than “normal” cells have. The viral protein that copies the RNA is called an “RNA-dependent RNA polymerase” (RdRp). This protein uses the viral RNA as a template to make a new copy of viral RNA, by stringing single ribonucleotides together like beads on a string. This process is called polymerization.

A study by the Morse lab at Texas A&M University showed that SARS-CoV-2 RNA polymerase has a remarkable similarity to the RNA polymerase of SARS-CoV (>95%) as well as MERS-CoV [1], the virus which causes Middle-Eastern Respiratory Syndrome. This means that research performed in response to the SARS and MERS epidemics can inform our response to SARS-CoV-2. Unfortunately, a lack of consistent pandemic-preparedness funding means that we didn’t learn as much about RdRp in time as we could have. Still, RNA polymerase might be a viable drug target for halting the spread and reducing the fatality rate of COVID-19.

Structure of the RNA-Dependent RNA Polymerase

By determining the structure of RdRp, and deeply understanding how it works, we can optimize a drug to specifically target it and hinder its function. To this end, in the last few months, several structures of SARS-CoV-2 RNA polymerase have been published. 

One interesting structure shows RNA polymerase in action, in the process of elongating an RNA strand (see Figure 1).[2] This structure clearly show the polymerase in complex with smaller proteins, non-structural protein 7 and 8 (nsp7 and nsp8). These proteins improve how well the RNA polymerase binds the template RNA and also how long it stays bound before dissociating – a feature called “processivity”.[3]

Figure 1. Front and back views of the structure of elongating RdRp with RNA and two cofactors, nsp7 and nsp8 (PDB ID: 6yyt). Two copies of nsp8 (grey) form sliding poles that help stabilize the RNA (orange ball-and-stick model). One copy of nsp8 binds to the polymerase (blue) directly, but the other copy uses nsp7 (pink) to anchor to a second position on the polymerase.

In the center of the protein is the area where the main action happens, called the “active site”. The amino acids of the polymerase that form the active site have a particular shape and chemical properties, which enable the polymerization reaction to occur very rapidly. In fact, the polymerase can string together as many as 100 nucleotides per second! [3] New RNA molecules can enter the active site through a little window to be added to the growing RNA chain. It is here that the antiviral drugs make their move!

Figure 2. The third view shows the window into the active site through which new nucleotides must enter!

How do antiviral drugs attack RNA-dependent RNA polymerase?

First, let’s talk about Gilead’s FDA-approved drug, Remdesivir, which has taken the spotlight in the search for COVID-19 cures. Remdesivir (which has a fancy chemistry ID, GS-5734, and is sold under the brand name Veklury), is a “nucleotide analog”, which means that it mimics the shape and chemistry of the nucleotides that make up RNA and DNA (see figure). 

Remdesivir was developed originally as a general antiviral drug and was later shown to protect cells (in a test tube) and monkeys (not in a test tube) from the Ebola Virus [4]. However, this was recent enough, and science is slow enough that, until the COVID-19 pandemic, large-scale clinical trials of Remdesivir hadn’t been done yet. So scientists and doctors have been rushing to test the drug in COVID-19 patients. In fact, the US and Japan both approved the drug for “Emergency Use Authorization'' for severe COVID-19 patients as early as May [5], [6]. And, in July, the European Medicines Agency gave Remdesivir a “conditional marketing authorization” (used for drugs that meet an unmet medical need but have insufficient data for normal approval). This allows the use of Remdesivir in severe COVID-19 patients through the next year [7]. So, how the heck does a drug for Ebola, Influenza, or some other viruses also work against COVID-19? I was concerned by this when the news about all the drug trials were coming out – and I’m sure I wasn’t the only one...

The simple answer to that is all these viruses need to do the same thing - copy their RNA genome from an RNA template. And in order to do that, they all end up using basically the same tool, an RNA-Dependent RNA polymerase. And all drugs that are nucleotide analogs use the very same trick: they dress up like ribonucleotides (the "beads on a string" from before) and fool the RNA polymerase into letting them into the active site. Once inside, they get “stuck” in the active site, jamming the polymerase machine. Since this trick should work for any viral RNA polymerase, we can use these drugs for any RNA virus, and call them ‘general antivirals’. Of course, in practice, this doesn't always work, because there are differences between the different RNA polymerases. However, it is a great place to start! In the future, if we have general antivirals for SARS-CoV-2 all ready-to-go, we may be better equipped to deal with another coronavirus outbreak!

Figure 3. We all see what we want to see, I guess.

The Chemistry of Remdesivir

Remdesivir resembles the nucleotide adenine in structure, although it has some fancy chemical add-ons which help make it a better drug (thank you, medicinal chemistry!). When Remdesivir is injected into a vein, it travels through the bloodstream and enters into our cells, which recognize it as a foreign substance and try to digest it. However, what ends up happening is that the cells remove just the fancy chemical add-ons, and then confuse it for a normal adenine nucleotide. In infected cells, the viral RNA-dependent RNA polymerase then starts grabbing these molecules and inserting them into the new viral RNA strand in place of adenine molecules. Remdesivir, now attached to the RNA, jams the polymerase, rendering the virus unable to make more copies of its genome. Ultimately, this halts viral replication and helps the patient fight off the virus.

Figure 4. (A) The red part of Remdesivir makes it a better drug by helping it get from the blood stream into human cells, but it isn’t necessary for jamming the polymerase. It was designed on purpose so that when it gets inside human cells, the cells try to digest it. When they do, they cleave off the red bits, causing it to get confused for an adenine nucleotide.  (B) This causes the cell to add two more phosphates to the molecule, making it the ‘tri’-phosphate form. This is the active form of the molecule, which mimics ATP (C), and is incorporated into the growing RNA chain in the place of ATP. The extra bit sticking off the side (in blue) is called a 1’-cyano group, and makes the RNA get stuck inside the polymerase, jamming it.
Figure 5. Structure of Remdesivir (cyan) in the active site of RNA-dependent RNA polymerase. The window through which new nucleotides enter is to the bottom left of the image. The RNA (orange ball-and-stick model) template strand enters from the bottom right. Remdesivir makes base-pair hydrogen bonds with the opposite uracil base.

Another drug that inhibits the RNA polymerase activity is Favipiravir, sold under brand names Avigan, Abigan, and FabiFlu. Favipiravir has been discovered by Toyama Chemical Co., Ltd. in Japan and it has a similar mechanism to Remdesivir, except that it mimics a guanosine nucleoside instead of an adenine nucleotide [8]. This drug was approved in Japan back in 2014 for use in resistant cases of Influenza A and B, but still remains unapproved in the US (still in Phase II and Phase III clinical trials) and the UK [9]. This drug is also being tested for use against Ebola virus, Lassa virus, and currently SARS-CoV-2 in 43 countries. The approval of Favipiravir for  COVID-19 has been much faster in China (Mar 15, 2020), Russia (Jun 3, 2020), and India (Jun 20, 2020)[10], [11]. Nonetheless, other countries, including Japan, are in various stages of clinical trials, and the results are anticipated to be out by the end of July [10].

So...do we have a cure for SARS-CoV-2?

Sadly, not yet. While the speed at which Remdesivir has gone through clinical trials is unprecedented, more work needs to be done to make sure it is safe and effective. Since (in the big scope of things) not a lot have people have taken Remdesivir, we aren’t really sure what all the side effects are, although there is emerging evidence for liver and kidney damage [12, 13]. The most common side effects are nausea (10% and 9% of patients), indigestion (7%) and increase of transaminases (6% and 8%). In one study, 3.6% of patients in a 10-day trial needed to stop taking therapy due to the latter. However, serious viral infections can also cause liver damage, so separating the two causes is a challenge! Remdesivir is not a cure-all, either. In one study it improved the recovery time from 15 days to 11 days, but it showed no effect for patients with mild to moderate disease, and no difference in median recovery time for patients who were already on a ventilator [14]. Since the drug has to be given by infusion over several days, there is a pretty small window in which Remdesivir can actually help. 

Likewise, Favipiravir has its own side effects such as liver damage, elevated uric acid levels, kidney damage, skin allergies, etc. [15]. These effects restrict it for use by severe diabetes and heart patients. On top of that, it is not suitable for pregnant women because it can cause potential fetal deaths and deformities. It has been shown that Favipiravir works only during the earlier stages of SARS-CoV-2 infection when the body’s immune system isn’t totally drained, whereas it can result in a cytokine storm (when your immune system really freaks out) in severely ill patients. But, unfortunately, the virus doesn’t differentiate between humans while attacking, so a universal drug for COVID-19 has to be safe for use by all people. 

However, these drugs are better than nothing, and by understanding the mechanisms involved, scientists can continue to improve upon the existing drugs for the benefit of all. While most of the ‘general antivirals’ that target RNA Polymerase have failed with SARS-CoV-2, Remdesivir has been relatively successful. Scientists think that this is actually because of a proofreading protein in SARS-CoV-2 called exonuclease. Immediately after the RNA-polymerase makes new RNA, exnuclease checks to make sure the new RNA is correct. In one study, another drug that mimics RNA called Ribivarin was shown to be removed from newly synthesized RNA by exonuclease [16]. Thankfully, Remdesivir is not excised , which is likely why it has been more successful than the other options [17], [18]. To read more about how nsp14 maintains the integrity and virulence of SARS-CoV-2, tune in to a future blog entry!

Figure 6. Hey, we've all been there.

Recommended Structures

For those interested in reviewing the structures further, they are available in our GitHub repo, along with information about validation and, where relevant, improved structures. For a high-resolution comparison of the active site with and without Remdesivir, 7BV2 and 7BV1 (respectively) were published together at 2.5 and 2.8 Å. The elongating structure of the complex shown above (6YYT) has the polymerase as well as the cofactors and RNA very well resolved, with little "missing" density and a resolution of 2.9 Å. It is likely preferable to 6M71 and 7BTF, which were published with a similar resolution but with less of the complex resolved, and no RNA. For those interested, 7C2K and 7BZF (at 2.93 Å and 3.26 Å) show the complex bound to RNA in a pre- and post-translocation state.

Sources

[1] J. S. Morse, T. Lalonde, S. Xu, and W. R. Liu, “Learning from the Past: Possible Urgent Prevention and Treatment Options for Severe Acute Respiratory Infections Caused by 2019-nCoV,” ChemBioChem, vol. 21, no. 5, pp. 730–738, Mar. 2020, doi: 10.1002/cbic.202000047.

[2] H. S. Hillen, G. Kokic, L. Farnung, C. Dienemann, D. Tegunov, and P. Cramer, “Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase,” Nature, May 2020, doi: 10.1038/s41586-020-2368-8.

[3] W. Yin et al., “Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir,” Science, p. eabc1560, May 2020, doi: 10.1126/science.abc1560.

[4] R. T. Eastman et al., “Remdesivir: A Review of Its Discovery and Development Leading to Emergency Use Authorization for Treatment of COVID-19,” ACS Cent. Sci., May 2020, doi: 10.1021/acscentsci.0c00489.

[5] O. of the Commissioner, “Coronavirus (COVID-19) Update: FDA Issues Emergency Use Authorization for Potential COVID-19 Treatment,” FDA, May 04, 2020. https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-issues-emergency-use-authorization-potential-covid-19-treatment (accessed Jul. 08, 2020).

[6] A. Sternlicht, “Japan Approves Remdesivir For Use On Severe COVID-19 Patients,” Forbes. https://www.forbes.com/sites/alexandrasternlicht/2020/05/07/japan-approves-remdesivir-for-use-on-severe-covid-19-patients/ (accessed Jul. 08, 2020).

[7] D. CZARSKA-THORLEY, “First COVID-19 treatment recommended for EU authorisation,” European Medicines Agency, Jun. 25, 2020. https://www.ema.europa.eu/en/news/first-covid-19-treatment-recommended-eu-authorisation (accessed Jul. 10, 2020).

[8] E. De Clercq, “New Nucleoside Analogues for the Treatment of Hemorrhagic Fever Virus Infections,” Chem. Asian J., vol. 14, no. 22, pp. 3962–3968, Nov. 2019, doi: 10.1002/asia.201900841.

[9] K. Shiraki and T. Daikoku, “Favipiravir, an anti-influenza drug against life-threatening RNA virus infections,” Pharmacol. Ther., vol. 209, p. 107512, May 2020, doi: 10.1016/j.pharmthera.2020.107512.

[10] T. Hornyak, “Japan sending Fujifilm’s flu drug favipiravir to over 40 countries for Covid-19 trials,” CNBC, May 04, 2020. https://www.cnbc.com/2020/05/04/fujifilms-flu-drug-favipiravir-sent-to-43-nations-for-covid-19-trials.html (accessed Jul. 14, 2020).

[11] G. P. Ltd, “Glenmark Becomes the First Pharmaceutical Company in India to Receive Regulatory Approval for Oral Antiviral Favipiravir, for the Treatment of Mild to Moderate COVID-19.” https://www.prnewswire.com/in/news-releases/glenmark-becomes-the-first-pharmaceutical-company-in-india-to-receive-regulatory-approval-for-oral-antiviral-favipiravir-for-the-treatment-of-mild-to-moderate-covid-19-855346546.html (accessed Jul. 14, 2020).

[12] Goldman, J. D. et al. Remdesivir for 5 or 10 Days in Patients with Severe Covid-19. N. Engl. J. Med. (2020) doi:10.1056/NEJMoa2015301

[13] Remdesivir Safety Forecast: Watch the Liver, Kidneys | MedPage Today. https://www.medpagetoday.com/infectiousdisease/covid19/86582

[14] J. H. Beigel et al., “Remdesivir for the Treatment of Covid-19 — Preliminary Report,” N. Engl. J. Med., vol. 0, no. 0, p. null, May 2020, doi: 10.1056/NEJMoa2007764.

[15] Sandhya Ramesh, “Favipiravir, Japanese drug that’s the new Covid treatment hope your chemist will soon stock,” ThePrint, Jun. 25, 2020. https://theprint.in/health/favipiravir-japanese-drug-thats-the-new-covid-treatment-hope-your-chemist-will-soon-stock/447987/ (accessed Jul. 14, 2020).

[16] F. Ferron et al., “Structural and molecular basis of mismatch correction and ribavirin excision from coronavirus RNA,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 115, no. 2, pp. E162–E171, Jan. 2018, doi: 10.1073/pnas.1718806115.

[17] C. J. Gordon, E. P. Tchesnokov, J. Y. Feng, D. P. Porter, and M. Gotte, “The antiviral compound remdesivir potently inhibits RNA-dependent RNA polymerase from Middle East respiratory syndrome coronavirus,” J. Biol. Chem., Feb. 2020, doi: 10.1074/jbc.AC120.013056.

[18] L. Zhang et al., “Role of 1’-Ribose Cyano Substitution for Remdesivir to Effectively Inhibit both Nucleotide Addition and Proofreading in SARS-CoV-2 Viral RNA Replication,” bioRxiv, p. 2020.04.27.063859, Apr. 2020, doi: 10.1101/2020.04.27.063859.

Das Coronavirus unkompliziert selbst drucken und zusammenbauen – wir haben ein 3D-Modell dafür entworfen!
Abhängig vom User und dem jeweiligen 3D-Drucker sind die Details natürlich unterschiedlich. Die Methoden, die wir angewandt habenkönnen aber als Anhaltspunkt dienen. Nutzer ohne eigenen 3D-Drucker können die STL-Daten aber auch dafür verwenden, den Druck bei einem externen Dienstleister zu beauftragen. Wir hoffen, mit diesem Projekt nicht nur private Nutzer zu erreichen, sondern auch bessere Möglichkeiten für die Lehre und das öffentliche Verständis des Virus zu schaffen.

Unser Entwurf basiert auf aktuellesten wissenschaftlichen Erkenntnissen bezüglich der Proteinstrukutur und Größenverhältnisse. Mehr dazu hier.

Mit dem ausgedruckten und zusammengebauten Modell bekommt man eine Vorstellung, wie das Virion aussehen würde, wenn es um eine Million vergrößert wäre (1 mm des Models stellt 1 nm (10 Å) dar). Die RNA, das Erbgut des Virus, wäre dann zehn Meter lang und einen Millimeter dick.

Zusätzlich haben wir ein Modell eines menschlichen Antikörpers im selben Maßstab entworfen, welches zusätzlich zu den Strukuren des Virions gedruckt und je nach Wunsch an das Spike-Protein angehägt werden kann. Um das Drucken, Bemalen und Zusammenbauen zu erleichtern, haben wir die Virusstruktur in vier einzelne Komponenten zerlegt:

Bis jetzt wurden die Strukturen erfolgreich auf verschiedenen Schmelzschicht-Druckern (FDM), einem Rostok MAX v2 und einem Prusa I3 MK3 Drucker getestet. Mit anderen Methoden, wie Stereolithographie, wäre eine noch höhere Qualität durchaus möglich.

Jeder Teil ist im STL-Format verfügbar und sollte mit jeder geeigneten Slicer-Software druckbar sein.

Beim Zusammenbauen und Bemalen des fertigen Drucks geht man am besten nach eigenem Gutdünken vor. Die exakten Details unterschieden sich schließlich je nach Equipment und nach den Einstellungen.
Wir zeigen hier trotzdem unseren Aufbau in knapper Zusammenfassung.

Druck der Komponenten:

Der erste Schritt ist das Drucken der einzelnen Bestandteile. Die Virion-Kugel ist schnell gedruckt, da durch die flache Oberfläche keine weiteren Träger oder Verbindungen benötigt werden.
Dieser Teil kann mit einem Minimum an Füllung und Trägern gedruckt werden, aus Gründen der Stabilität empfehlen wir jedoch eine Füllung von mindestens 10%.

Die anderen Teile (Spikeproteine und Antikörper) stellen hierbei eine größere Herausforderung dar.
Das Spikeprotein muss für das fertige Model mindestens 95mal gedruckt werden. Hierzu können entweder individuelle Einstellungen genutzt oder die 25x STL-Datei 4mal gedruckt werden.
Es ist empfehlenswert das Spike-Protein mit dem Kopf in Richtung Druckbett zu drucken. Das erhöht die Stabilität und benötigt weniger Verbindungen und Vernetzungen zwischen den einzelnen Trägern.
Diese müssten sonst mit Fingerspritzengefühl vom sensiblen Stamm der Spikes entfernt werden. Wie viele Träger zusätzlich hinzugefügt werden, kann je nach Nutzer und der jeweiligen Situation entschieden werden.

Ein Dual-Extruder-Drucker ist für das Herstellen der Spikes ideal, da die stabilisierenden Verbindungen zwischen den Spikes aus einem wasserlöslichen Plastik gedruckt und somit einfach zu entfernen sind. Auf jeden Fall erzeugt ein individueller Druck der Spikes oder zumindest eine geringere Anzahl pro Block ein besseres Ergebnis. Die Verarbeitung dieser Spikes ist dann einfacher, auch wenn der Druck zeitaufwändiger wird. Generell muss ein guter Kompromiss zwischen der Druckgenauigkeit, der Geschwindigkeit und dem Aufwand beim Aufarbeiten der Modelle gefunden werden.

Die Details dieses Prozesses hängen vor allem von der Art des Druckers, dem Aufbau und der Drucktechnik ab. Wir nutzten die bekannteste Technik: Schmelzschicht-Druck (FDM), als Plastik wurde Polylactide (PLA) verwendet, was die folgende Aufreinigung erleichterte.

Aufarbeitung

Um die Objekte möglichst sauber zusammensetzen und bemalen zu können, ist eine Aufarbeitung der Einzelteile notwendig. Die Stabilisierungsstücke können mit einer Zange entfernt werden, während kleinere Artefakte einen Abschliff benötigen. Auch ein Zahnstocher hat sich als hilfreich erwiesen.

Links die Virion- und Spike-Protein- Oberflächen nach dem Druck, mit erkennbaren Artefakten und Plastik-Fadenbildung . Auf der rechten Seite das mit Ethylacetat behandelte Virion mit einer glatten Oberfläche. Bilder von Ferdinand Kirsten, Matt Reeves.
Links die Virion- und Spike-Protein- Oberflächen nach dem Druck, mit erkennbaren Artefakten und Plastik-Fadenbildung . Auf der rechten Seite das mit Ethylacetat behandelte Virion mit einer glatten Oberfläche. Bilder von Ferdinand Kirsten, Matt Reeves.

Für PLA erwies sich Ethylacetat als die beste Reinigungsmethode um Oberflächen zu glätten und Überbleibsel der Träger zu entfernen. Das Ethylacetat löst das Plastik auf und zerstört somit kleine Unebenheiten auf den Oberflächen, wenn es bedacht angewendet wird. Hierbei kann unterschiedlich vorgegangen werden, wobei die schonendste Methode das Aussetzen in eine Ethylacetat-Dampf Umgebung in einem geschlossenen Gefäß ist. Es entsteht eine glatte Oberfläche mit genauen Details, der Prozess nimmt jedoch oft viele Stunden oder sogar einige Tage in Anspruch.

Die schnellere Methode , die ebenfalls zufriedenstellende Resultate liefert, ist das Eintunken der Objekte in Ethylacetat für 10-30 Sekunden. Anschließend werden sie abgetupft und zum Trocknen ausgelegt. Oft ist ein zweiter Reinigungsgang nötig. Für die größeren Virusteile kann es helfen ein Tuch, welches mit Ethylacetat getränkt ist, bis zum gewünschten Ergebnis über die Oberfläche zu reiben. Mit dieser Methode lassen sich die beiden Virionhälften auch hervorragend zusammenkleben. Eine kleine Menge Ethylacetat wird auf jeder Fläche der Hälften verteilt und die Hälften zusammengedrückt, bis sie zu einem einzigen Stück verschmolzen sind. Auch die Naht kann dann mit einem Ethylacetat-Tuch gut geglättet werden. Hierfür stellt Aceton-freier Nagellackentferner eine ausgezeichnete, frei käufliche Alternative dar, die die gleichen Ergebnisse erzielen dürfte. Bei der Handhabung dieser Chemikalien sollte immer geeignete Schutzausrüstung getragen werden ( Schutzbrille, Handschuhe etc.).

Spike-Proteine Frisch nach dem Druck (links) und nach der Aufarbeitung mit Ethylacetat (rechts), Bild von Ferdinand Kirsten.
Spike-Proteine frisch nach dem Druck (links) und nach der Aufarbeitung mit Ethylacetat (rechts), Bild von Ferdinand Kirsten.

Übrigens: Aceton erzielt für das andere häufig genutzte Druckmaterial, Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) die gleiche Wirkung wie Ethylacetat für PLA.

Bemalen und Zusammensetzen

Wie beim Druck, sind auch das Bemalen und die jeweiligen Malmethoden dem Nutzer individuell überlassen. Hier zeigen wir die Variante des Würzburger Modells, bei der wir versucht haben, der Illustration von Thomas Splettstösser möglichst treu zu bleiben.

Am Computer erstelltes Bild des Virusses von Thomas Splettstoesser (links) und das ferige 3D-Modell des Thorn Labs (rechts).
Am Computer erstelltes Bild des Virusses von Thomas Splettstoesser (links) und das ferige 3D-Modell des Thorn Labs (rechts).

Die Einzelteile wurden zu Beginn mit einem Primer überzogen, um die Farbe besser an das Modell zu binden. Außerdem wirkt dieser wie eine gleichmäßige Grundierung. Beim Auftragen des Primers und der Nutzung einer Airbrush muss auf die Sicherheit geachtet werden, um das Einatmen der schädlichen Substanzen zu vermeiden. Ein gut belüfteter Raum, ein Abzug und eine Zirkulation weg vom Körper sind zu empfehlen. Das Tragen von Handschuhen, einer Schutzbrille und einer Maske sollte für zusätzlichen Schutz sorgen.

In unserem Fall wurde das Modell hauptsächlich mit einer Airbrush bemalt und wir empfehlen diese Methode für die kleinen Oberflächendetails und komplexen Strukturen. Natürlich können auch alle Teile mit dem Pinsel angemalt werden, dies ist jedoch deutlich zeitaufwendiger und erfordert genaueres Arbeiten. Alle genutzen Farben, Verdünner, Primer und Lack sind von Citadel-Painting. Hier eine Liste der genutzten Farben und Amterisleien die für unser Modell verwendet wurden:

  • Grün: “Moot green”
  • Gelb: “Yriel Yellow”
  • Grau: “Dawnstone”
  • Braun: “Baneblade Brown”
  • Dunkelbraun: “Doombull Brown”
  • Hellblau (Aqua): “Gauss Blaster Green”
  • Türkis: “Kabalite Green”
Die Spike-Proteine Sortiert nach Farben (links oben), nur mit Grundierung (links unten) und nach dem Hervorheben mit Limettengrün (rechts). Bild von Kristopher Nolte.
Die Spike-Proteine Sortiert nach Farben (links oben), nur mit Grundierung (links unten) und nach dem Hervorheben mit Limettengrün (rechts). Bild von Kristopher Nolte.

Um den Effekt einer natürlichen Lichtquelle zu erzeugen wurden die Spikes in vier Gruppen unterteilt und unterschiedlich hell bemalt.
Wenn das Modell nicht für die feste Ausstellung auf einer Halterung oder Ähnlichem geplant ist, ist dieser Schritt nicht notwendig. Jedes Spike-Protein wurde mit einem helleren Limettengrün hervorgehoben (Highlighting), um einen stärkeren Kontrast zu erzeugen und die Oberfläche besser zu differenzieren. Anschließend wurde das Highlighting mit einem "Dry-brush" der hellblauen (Aqua) Farbe vollendet.

Virion-Kugel (oder auch liebevoll Kartoffel genannt) mit hervorgehobenen Hüllenproteinen (links) und nach der Grundierung (rechts). Bild von Kristopher Nolte.
Virion-Kugel (oder auch liebevoll Kartoffel genannt) mit hervorgehobenen Hüllenproteinen (links) und nach der Grundierung (rechts). Bild von Kristopher Nolte.

Nachdem das Virusmodell samt Spikes bemalt war, wurde die Farbe mit Glanzlack und einem matten Finish versiegelt. Dieser Schritt ist ebenfalls optional, aber zum Schutz gegen Abnutzung der Farben bei häufiger Handhabung des Modells zu empfehlen.

Nach all diesen Schritten kommt es endlich zum langersehnten Zusammensetzen der Einzelteile. Falls die Spike Proteine verschiedene Highlights bekommen haben, ist darauf zu achten, sich auf eine „Lichtquelle“ festzulegen und die Spikes dementsprechend anzuordnen und am Modell zu befestigen (Auf einem Ständer: Unten dunkler, nach oben heller). Um die Spikes an ihrer Position zu befestigen haben wir normalen Modellbaukleber verwendet. Starker Bastel-Kleber oder Ethylacetat können hierfür ebenfalls benutzt werden, sowie kleine Magnete für besondere Tüftlerinnen und Tüftler. Da unser Modell auf einer Halterung präsentiert werden soll, wurde hierfür ein Loch an der Unterseite des Modells freigelassen, in dem dann die Stange befestigt werden kann.

Zusammensetzen des Modells mit Kleber. Die Spike-Proteine werden in den dafür vorgesehenen Löchern befestigt. Bild von Kristopher Nolte.
Zusammensetzen des Modells mit Kleber. Die Spike-Proteine werden in den dafür vorgesehenen Löchern befestigt. Bild von Kristopher Nolte.

Hoffentlich hat euch unser kleines Abenteuer gefallen und inspiriert, euch an euer eigenes 3D-Coronamodell zu wagen. Die beschriebenen Arbeitsschritte haben insgesamt etwas mehr als eine Woche in Anspruch genommen. Das Drucken dauert etwa einen Tag.  Aufreinigung und Verfeinerung benötigten mehr als zwei Tage und das Bemalen des Modells ein ganzes Wochenende.

Die Dateien sind öffentlich auf Thingiverse verfügbar und das Modell ist lizensiert als Creative Commons BY-NC: Frei Verwendung und Veränderung für nicht-kommerzielle Zwecke und unter Nennung der "Coronavirus Structural Task Force" als Urheber.

3D-Druck Illustration von Thomas Splettstoesser (links) im Vergleich mit dem Modell von Dale Tonrud aus Oregon (mitte) und dem Thorn Lab aus Würzburg (rechts).
3D-Druck Illustration von Thomas Splettstösser (links) im Vergleich mit dem Modell von Dale Tonrud aus Oregon (mitte) und dem Thorn Lab aus Würzburg (rechts).

Wie bei jedem 3D-Modell, gibt es weit mehr als einen Weg, diese Aufgabe anzugehen und zu vollenden. Wir freuen uns, darauf, Eure Modelle zu sehen und mit Euch über Herangehensweisen und Techniken zu diskutieren - hier in den Kommentaren, auf Thingiverse oder Twitter!

Die Autoren:

Wir möchten hervorheben, dass dieser Artikel eine Zusammenarbeit mehrerer Leute ist:

Dale Tonrud und Thomas Splettstösser haben zusammen die STL Dateien für das 3D Modell erstellt und verfeinert. dale hatte die Idee, ein Modell zu drucken und diese wurde dann von Andrea Thorn aufgegriffen. Thomas und Dale sorgten dann dafür, das Modell möglichst realistisch und gleichzeitig gut für Handhabung und Druck in Einzelteilen zu gestalten. Dale druckte das erste Design des Modells aus.
Matt Reeves war für die Optimierung und den Druck des Würzburger Modells zuständig. Er fand heraus, wie das Modell am besten nachbearbeitet wird und trug zusammen mit dem Rest des Teams zur Verbessung des Modells bei.
Kristopher Nolte arbeitete zusammen mit Ferdinand Kirsten das gedruckte Modell auf und reinigte es. Kristopher war zudem für die filigrane Arbeit des Bemalens und Zusammensetzens des fertigen Virions verantwortlich.

Dieser Artikel ist übersetzt von Ferdinand Kirsten, Pairoh Seeliger und Kristopher Nolte, nach dem originalen Artikel in Englisch von Kristopher Nolte, Dale Tonrud und Matt Reeves.

Das Coronavirus ist unsichtbar; man kann es mit bloßem Auge nicht sehen - und das ist ein großes Problem.
Wenn ein Haus lichterloh in Flammen steht, dann erkennen wir die Gefahr sehr leicht. Wir würden sofort reagieren: Das Haus verlassen, die Feuerwehr rufen und die Nachbarn warnen. Beim Coronavirus ist die Gefahr leider nicht so klar erkennbar; man kann SARS-CoV-2 weder sehen noch anfassen. Zwischen Infektion und der Erkrankung vergehen einige Tage (1) und dann im Mittel noch einmal 16 Tage bis zum Tod - im schlimmsten Fall (2).
Stell dir eine Katastrophe vor, die in New York City 32.362 Menschen tötet. Genau diese Zahl – ein Toter pro 250 Einwohnern – ist in den letzten Monaten in New York an COVID-19 gestorben (3). Die Unsichtbarkeit, Ungreifbarkeit der Bedrohung macht es schwierig, die Gefahr richtig einzuschätzen und entsprechende Schutzmassnahmen zu ergreifen: Masken zu tragen und Abstand zu halten. Es ist schwer, sich einer unsichtbaren Bedrohung bewusst zu werden und noch schwieriger, wenn man die Bedrohung nicht versteht.

Deswegen wollen wir, dass Menschen das Virus sehen, oder noch besser: Es anfassen können - und dafür haben wir ein dem aktuellen Wissenstand entsprechendes 3D-Modell entworfen.
Und das Beste daran: Wir stellen die Druckdateien kostenfrei zur Verfügung, weil unsere Arbeit mit öffentlichen Geldern finanziert wird. (Bei Verwendung der Druckdateien bitten wir um einen Hinweis auf die Coronavirus Structural Task Force als Urheber.)

3D printed corona vrisu model
Das gedruckte und bemalte 3D-Modell. (Photo: Judith Flurer / RVZ.)

Unser Modell sieht anders aus als die Coronaviren aus den Medien. Warum?

Zunächst einmal gilt zurzeit einfach jeder beliebiger Stachelball in den Medien als Coronavirus. Aber „unser“ Virus unterscheidet sich aber auch von der Illustration des CDC, die von den beiden medizinischen Illustratoren Alissa Eckert und Dan Higgins erschaffen wurde. Die Hauptunterschiede zwischen deren rot-grauen Darstellung und unserer sind:

  • Der Virus ist nicht wirklich rund, eher etwas wobbelig. Das zeigt unser 3D-Druck auch.
  • Die Anzahl der E-Proteine (orange), M-Proteine (gelb) und Stacheln (grün) stimmt mit den neuesten Erkenntnissen überein. (4)
  • Die Stacheln sind länger als in der CDC-Abbildung, weil wir jetzt mehr über die Struktur des Virus wissen
  • Die Virushülle ist im Vergleich zu den Stacheln kleiner. Die Größe variiert und die Größe unseres Modells ist ein Durchschnittswert.
  • Die Stacheln sind glykolisiert, und dadurch werden sie unregelmäßiger (und schleimiger). Die Glykosilierung ist in der Animation (unten) grau abgebildet. Das könnte man am Modell mit Watte darstellen, die man an den Stacheln anbringen könnte.
  • Wir zeigen das E-Protein (gelb) als fünfzähligen Pore. Ob das eine korrekte Annahme ist, bleibt abzuwarten. Wenn du darüber mehr erfahren möchtest, siehe hier.
  • Wir haben uns für eine Farbgebung entschieden, die der schleimigen, feuchten Umgebung entspricht, in der das Virus Wirtszellen befällt. (Die rote und graue Farbwahl des CDC zielt darauf ab, die Bedrohung zu verdeutlichen, die das Virus darstellt. (5)
Merge of two virus representations
Vergleich zwischen unserer Darstellung (Thomas Splettstößer / SciStyle.com) und der in den Medien häufig verwendeten Illustration dec CDC.

Wir haben auch ein Rhinovirus und einen Antikörper im selben Maßstab in den Dateien hochgeladen. Der Antikörper bindet spezifisch an den Stachel. Auf diese Weise erkennt das Immunsystem den Virus – und am Rhinovirus kann man gut erkennen, wie groß SARS-CoV-2 im Vergleich zu anderen Viren ist. Eigentlich sollte man es "Viruspartikel" nennen, denn es handelt sich dabei nur um die Transportform des Virus, mit der es verbreitet wird. Wenn es eine Wirtszelle befällt, werden aus dem im Virion enthaltenen Erbgut viele weitere Moleküle produziert, die die Wirtzelle in ihrem Sinn ez ueiner Virusfabrik umbauen - diese Proteine sind auch ein Teil des Virus, und ein wichtiger Bestandteil unserer Forschung.

Erstelle Dein eigenes 3D Modell! Hier kannst du die Dateien und die Anleitung zum 3D Druck und der Gestaltung finden!

Quellen:

(1) Rothan Hussin A., and Byrareddy Siddappa N. "The epidemiology and pathogenesis of coronavirus disease (COVID-19) outbreak." Journal of autoimmunity (2020): 102433. pmid:32113704

(2) https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/26/7/20-0282_article

(3) 32.362 deaths by 31th of July 2020 as reported by the New York Times in 8.4 million inhabitants (US Census Bureau) gives 0,39 %, roughly equalling 1 in 250.

(4) https://www.nytimes.com/2020/04/01/health/coronavirus-illustration-cdc.html

Proteine sind komplexe und empfindliche, große Moleküle (sogenannte Makromoleküle), deren Strukturanalyse uns sehr viel über ihre Funktion verraten kann. Doch die Messung ist komplizierter als man annehmen mag. Man kann nicht einfach einen Blick durch ein Mikroskop werfen, fokussieren und das Protein sehen. Man kann es sich wie das Röntgenbild eines Arms vorstellen, mit dem kleinen Unterschied, dass der Arm hierfür abgenommen, tausendfach vervielfältigt und kristallisiert werden müsste, bevor er mit Röntgenstrahlen beschossen wird. Nachdem man sich dann noch mit viel Mathematik herumgeschlagen hat, würde man so das fertige Bild eines Arms erhalten.

Unterschiedliche Methoden

Die experimentell ermittelten Molekülstrukturen aus dem Coronavirus können aus drei Quellen stammen: Röntgenkristallographie, Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) oder Kernspinresonanz in Lösung (NMR). Jede dieser Methoden bringt dabei ihre ganz eigenen Vor- und Nachteile mit sich. Kombiniert man diese Methoden miteinander und mit weiteren Techniken wie Massenspektrometrie, chemischer Quervernetzung, fluoreszentem Resonanzenergietransfer und einigen Berechnungen, können die genauen Details der Molekülstruktur Stück für Stück ans Licht gebracht werden.

Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)

Wenn es darum geht, eine „große“ (aber immer noch sehr kleine) Molekülstruktur aufzulösen, kann die Elektronenmikroskopie einem einen ausgezeichneten strukturellen Überblick bieten. Im Gegensatz zu den anderen Techniken wird das Molekül direkt abgebildet. Das geschieht mit Hilfe eines Elektronenstrahls und eines Systems von Linsen. Der schwierige Teil ist dann die Umwandlung dieser 2D-Abbildungen in dreidimensionale Strukturen. Dafür bildet man das Objekt tausende Male aus verschiedenen Perspektiven ab, um es dann dreidimensional rekonstruieren zu können. Auch wenn Elektronenmikroskopie lange Zeit als Methode mit niedriger Auflösung galt, ermöglicht moderne Technologie eine immer höhere Auflösung, die fast den Detailreichtum der Röntgenkristallographie erreichen kann. Es können sogar Aminosäure-Seitenketten, Wassermoleküle auf den Oberflächen der Makromoleküle und Liganden erkannt werden.

Entstehung einer Kryo-EM Struktur. Ein Bild von tausenden verschiedenen Ansichten der Makromoleküle (A) und die 16 am häufigsten auftretenden in (B). Die fertige 3.3 Angstöm Struktur-Karte in (C). 
Original Bilder von: Matthies, D., Bae, C., Toombes, G.E., Fox, T., Bartesaghi, A., Subramaniam, S., Swartz, K.J. (2018) Life 2018;7:e37558, bearbeitet von  Ferdinand Kirsten, Lizenz: CC BY-ND 2.0
Entstehung einer Kryo-EM Struktur. Ein Bild von tausenden verschiedenen Ansichten der Makromoleküle (A) und die 16 am häufigsten auftretenden Ansichten in (B). Die fertige 3.3 Ångstöm Struktur-Karte in (C).
Original Bilder aus: Matthies, D., Bae, C., Toombes, G.E., Fox, T., Bartesaghi, A., Subramaniam, S., Swartz, K.J. (2018) Life 2018;7:e37558, bearbeitet von Ferdinand Kirsten, Lizenz: CC BY-ND 2.0

NMR-Spektroskopie

Ein wichtiger Teil der NMR-Spektroskopie ist die sogenannte Isotopenanreicherung. Während beim altbekannten MRT beim Arzt lediglich die Position der Atomkerne eines bestimmten Gewebes bestimmt werden kann, gestattet diese Methode eine genauere Analyse der Verteilung der Kohlenstoffatome. Dazu müssen sich die Kohlenstoffatome jedoch voneinander unterscheiden: Deshalb werden im Laufe des Aufarbeitungsprozesses verschiedene Isotope mit unterschiedlicher Neutronenzahl im Kern in das Proteinrückgrat eingebaut. Nach dieser Aufarbeitung wird das Protein einem starken Magnetfeld ausgesetzt und mit Radiowellen gemessen. Die entstehenden spezifischen Resonanzen jeder Substanz werden dann analysiert und man erhält Informationen über die Position jedes Kohlenstoff-Atomkerns im Verhältnis zu den anderen. Durch diese Positionsbestimmung kann man auf Distanzen oder mögliche chemische Bindungen schließen. Jetzt gilt es, das sudokuartige Rätsel richtig zu lösen, um ein atomares Modell des Moleküls erstellen zu können. Diese Methode eignet sich nur für kleine oder mittelgroße Moleküle, da größere Strukturen zu viel Überlappung in den Resonanzspektren verursachen. Die NMR-Spektroskopie kann jedoch damit punkten, dass die Messung flexibler Proteine in Lösung möglich ist. Sie ist an kein festes Stadium gebunden, das molekulare Bewegungen einschränken würde.

Darstellung eines Daten-Sets, dass aus NMR-Spektroskopie gewonnen wurde. Einige der Einschränkungen, die hier bei der Strukturlösung von Hemoglobin sind hier in gelb dargetsellt, das Protein in grün. (PDB: 1vre und 1vrf). Bild von PDB101.rcsb.org.
Darstellung eines Datensets, dass aus NMR-Spektroskopie gewonnen wurde. Das Protein ist in Grün dargestellt, die bekannten Abstände zwischen Kohlenstoffen sind gelb (PDB: 1vre und 1vrf). Bild von PDB101.rcsb.org.

Röntgenkristallographie

Die Röntgenkristallographie ist, von den hier behandelten Methoden, die am häufigsten genutzte. Insgesamt sind 145252 der Strukturen in der Protein-Datenbank mittels Röntgen-Kristallographie gemessen worden. Die NMR-Spektroskopie (12965 Strukturen) und die Kryo-Elektronenmikroskope (4926 Strukturen) sind weitaus seltener vertreten. Das große Manko der Röntgenkristallographie ist die Notwendigkeit eines Proteinkristalls, aber sie liefert enormen Detailreichtum. Mit ihr kann man die Atome jeder Aminosäure und sogar von Liganden, Inhibitoren, Ionen oder anderen Molekülen bestimmen. Gleichzeitig schränkt aber der aufwändige Prozess der Kristallisation die Möglichkeiten ein, welche Proteine gemessen werden können. Die Aufarbeitung der Proteine für die Kristallisation bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe. Nach der Aufarbeitung kann die Produktion eines messbaren Proteinkristalls einige Zeit, mitunter Jahre, in Anspruch nehmen. Ein besonderes Problem stellen dabei sehr flexible Proteine dar. Als Enzyme oder Rezeptoren besitzen Proteine häufig bewegbare Teile oder liegen in verschiedenen Konformationen vor, um vollständig funktionsfähig zu sein. Genau diese flexiblen Proteine sind leider oft die Interessantesten.
Ist der Kristall einmal hergestellt, wird er mit flüssigem Stickstoff gekühlt und mit einem intensiven Röntgenstrahl beschossen. Dieser Prozess ist vergleichbar mit einem Kristall, der ins Licht gehalten wird. Er wirft Reflektionen an eine Wand und diese werden dann angesehen. Die Röntgenstrahlen treffen den Kristall und werden in einem spezifischen Muster reflektiert. Diese Reflektionen sind kein direktes Bild des Kristalles, sondern müssen erst richtig interpretiert werden, um daraus auf die Kristallstruktur, also die molekulare Struktur im Kristall, schließen zu können. Die Verteilung der Elektronen kann aus den Reflektionen errechnet werden und liefert eine Elektronen-Dichtekarte, mit der die Position jedes einzelnen Atoms abgeschätzt werden kann.

Schematische Vorgehensweise bei der Röntgenkristallographie. Das kristallisierte Protein streut den Röntgenstrahl in einem spezifischen Muster. Dieses Muster wird über spezielle Algorithmen in eine Elektronen-Dichtekarte mit der Aufenthaltswahrscheinlichkeit jedes Atomes umgerechnet. Daraus kann dann ein Modell der Struktur gebaut werden.
Kristalle von Andrea Thorn, Diffraktionsmuster von Sabrina Stäb, Grafik von Ferdinand Kirsten.

Und dann...?

Die molekularen Modelle, die aus diesen Methoden gewonnen werden, eröffnen zahlreiche Möglichkeiten: Struktur-basiertes-Wirkstoffdesign, computerbasierte, dynamische Simulationen und natürlich Antworten auf wichtige biologische Fragen. Aber wie interpretieren wir diese Strukturen richtig, um alle biologischen Informationen zu bekommen? Das wird das Thema des nächsten Blog-Eintrags!

Zum Nachlesen (Englisch):

Früher wurden Arzneimittel zufällig gefunden, und manchmal ist das auch heute noch so. Aber in diesem Artikel geht es um sogenanntes rationales Arzneimitteldesign. Wir fangen an mit zwei wichtigen Begriffen:

Wirkstoffe und Targets

Die meisten Arzneimittel sind kleinere Moleküle mit bis zu 70 Atomen. Diese Wirkstoffe binden im Körper an das sogenannte Target, ein „Makromolekül“. Makromoleküle können Eiweißstoffe, DNA, RNA und Zuckerketten (Kohlenhydrate) sein. Die allermeisten Targets sind Eiweißstoffe – Proteine.

Proteine sind die Arbeitstiere unseres Körpers – sie zerlegen die Moleküle in unserer Nahrung, ermöglichen die Zellteilung, aus ihnen bestehen Muskeln und Haare. Ein Grund, warum unsere Ernährung Protein enthalten muss, ist, weil unser Körper dieses in seine Bausteine zerlegt und daraus neue Proteine bauen kann. Sie sind absolut essentiell für unser Überleben.

Ein Beispiel: So wirkt Aspirin

Aber nicht nur unser Körper hat Proteine, auch Krankheitserreger wie Bakterien oder Viren (sic). Und nicht alle Proteine sind gut: Bei Stoffwechselstörungen oder chronischen Krankheiten kann es sinnvoll sein, die Aktivität bestimmter Proteine zu vermindern. Ein gutes Beispiel hierfür ist Cyclooxygenase-II oder kurz COX. Dieses Protein wird bei Verletzung von Zellen und bei Entzündung im Körper gebildet und katalysiert einen wichtigen Schritt bei der Herstellung von Schmerzbotenstoffen, so genannten Prostaglandinen. Ohne dieses Cyclooxygenase-II können keine Schmerzbotenstoffe hergestellt werden.

Acetylsalicylsäure - auch bekannt als ASS oder Aspirin – bindet an Cyclooxygenase-II und macht diese kaputt (siehe Bild). Das führt dazu, dass keine Schmerzbotenstoffe mehr gebildet werden, und man weniger Schmerzen empfindet*. In diesem Fall ist also Cyclooxygenase-II das Target und ASS der Wirkstoff.

Hemmung von COX durch Aspirin
Links: Cyclooxygenase-II, ein Eiweißstoff, der Schmerzbotenstoffe herstellt. Rechts: Acetylierung (4 rote Atome) durch Acetylsalicylsäure, auch genannt Aspirin. Diese blockiert den Kanal und das katalytische Zentrum, so dass Cyclooxygenase keine Schmerzbotenstoffe mehr herstellen kann. Die Wirkung hört erst auf, wenn der Körper neue Cyclooxygenase-II hergestellt hat (also einige Stunden). Bild von Andrea Thorn.

Arzneimittelentwicklung

Zur Arzneimittelentwicklung werden zwei Hauptmethoden eingesetzt:

Indirektes oder Liganden-basiertes Wirkstoffdesign testet Moleküle, die bereits bekannten Arzneimitteln in Ladung und Gestalt ähnlich sind. Diese werden darauf getestet, ob sie an das Target binden und es hemmen.

Direktes oder Struktur-basiertes Wirkstoffdesign beruht auf der Kenntnis des Targets und der Wirkstoff wird so ausgewählt, dass er an das Target bindet. Beim Fragment-basierten Wirkstoffdesign werden kleinere Moleküle an verschiedene Stellen im Target gebunden und mit diesem Wissen dann ein Wirkstoff synthetisiert, der die Eigenschaften der Fragmente in  einem Molekül vereint.

Für beide Hauptmethoden kann eine Vorauswahl von möglichen Wirkstoffen mithilfe von Computerberechnungen getroffen werden, aber für Struktur-basiertes Wirkstoffdesign muss die Struktur des Makromoleküls genau bekannt sein.

Die Coronavirus Structural Task Force hilft bei der Suche nach einem Arzneimittel, indem wir die makromolekularen Strukturen von möglichen Targets, nämlich den Proteinen des Coronavirus, überprüfen und zum Teil sogar verbessern. Außerdem bieten wir Wirkstoffdesignern Informationen zu den verschiedenen Makromolekülen an. Auf diese Art und Weise hoffen wir, einen Beitrag zur Bekämpfung des Virus zu leisten.

*Leider werden statt Prostaglandinen dann mehr Leukotriene produziert, die bei Asthmatikern einen Anfall auslösen können – deswegen sollen Asthmatiker Aspirin nur nach Absprache mit dem Arzt nehmen.

(Titelbild: Aspirintabletten von Ragesoss, Wikimedia Commons / license: CC 4.0)

SARS-CoV-2: Nicht neu, aber anders

Das neuartige Coronavirus (SARS-CoV-2 oder 2019-nCoV) ist ein großes Einzelstrang-RNA Virus mit positiver Polarität. Es ist der Familie der Betacoronaviren zugeordnet und zeigt große genetische Ähnlichkeit zu SARS-CoV und MERS-CoV und ist besonders nah verwandt mit dem Bat-SARS-like-CoV (Fledermaus-Coronavirus), von dem es wahrscheinlich auch abstammt. Trotz vieler Gemeinsamkeiten erkennt man, wenn man den Infektionsmechanismus und die Struktur seiner Proteine genau analysiert, eindeutige Unterschiede zu SARS-CoV und anderen Coronaviren.

Ein wertvoller Inhalt

Wie fast alle RNA-Viren besitzt das Virus eine Lipid-Hülle, in die diverse Proteine integriert sind. Diese Hülle ist zuständig für die Interaktion mit der Wirtszelle und dient dem Schutz des Erbgutes, der viralen RNA. Diese RNA dient unter Anderem als direkte Vorlage für die Herstellung der beiden Polyproteine pp1a und pp1ab, die für 16 nicht-strukturelle-Proteine (nsp) kodieren. Diese 16 nsps, kodiert von etwa zwei Dritteln der gesamten Genom-Länge, werden von der Chymotrypsin-artigen-Protease (=Hauptprotease) und ein oder zwei Papain-artigen-Proteasen aus der langen Polypeptidkette herausgeschnitten und so in funktionelle Proteine umgewandelt. Infolgedessen kann sich der Replikations-Transkriptions-Komplex (RTC) bilden und eine Vielzahl sogenannter subgenomischer RNAs (sgRNAs) bilden, die wiederum als Grundlage für die Produktion subgenomischer mRNA und neuer viraler Proteine dienen. Andere Bereiche des Genoms kodieren für mindestens vier Strukturproteine, die Teil der Virushülle sind und als Nucleokapsid die RNA stabilisieren (bezeichnet als S-, M-, E- und N-Protein für Spike, Membran, Hülle und Nukleokapsid)

3D-Darstellung der SARS-CoV-2 Struktur. Die Hüllen (E)-, Spike (S)- und Membran (M)-Proteine sind an die Lipidmembran gebunden, die einzelsträngige RNA und das Nukleokapsid (N)-Protein liegen im inneren vor. Grafik von Thomas Splettstoesser; www.scistyle.com.
3D-Darstellung der SARS-CoV-2 Struktur. Die Hüllen (E)-, Spike (S)- und Membran (M)-Proteine sind an die Lipidmembran gebunden, die einzelsträngige RNA und das Nukleokapsid (N)-Protein liegen im inneren vor. Grafik von Thomas Splettstoesser; www.scistyle.com.

Der erste Kontakt

Das Virus befällt hauptsächlich Zellen, die den Oberflächenrezeptor ACE2 (Angiotensin-konvertierendes Enzym 2) tragen. Dieser Zelltyp findet sich häufig im Gewebe der Atemwege und bei Kontakt der Viren mit der Zelle und ihren Oberflächenproteinen kann die virale RNA eingeschleust werden. Aber wie geschieht dieses Einschleusen? Das Spike-Protein, welches die "Korona" um das Virus bildet, tritt mit einem dafür spezialisierten Teil des Proteins, der Rezeptor-bindenden-Domäne in Kontakt mit der Wirtszelle. Anschließend können die Viren über den komplexen Prozess der Endozytose mit der Zelle verschmelzen und ihre Erbinformation so einschleusen. Sobald eine Zelle infiziert ist, fungiert sie als kleine Fabrik zur Herstellung hunderter neuer Virus-Moleküle, was eine starke Reaktion des Immunsystems hervorruft. Die bekanntesten Symptome umfassen Husten, Fieber, Atemnot, Müdigkeit, Geschmacksverlust, Kopfschmerzen, Diarrhö, Lymphopenie, oder Lungenentzündung, die in schweren Fällen sogar den Tod des Patienten verursachen können.

Crystal structure of spike protein receptor-binding domain from SARS coronavirus epidemic strain complexed with human-civet chimeric receptor ACE2, picture by Ferdinand Kirsten
Kristallstruktur der Rezeptor-bindenden-Domäne des Spike-Proteins aus einem Stamm des SARS-Coronavirus (2002-2003) (magenta) komplexiert mit dem humanen Rezeptor ACE2 (grün).
PDB: 3SCL, Bild von Ferdinand Kirsten

Die Struktur und der Infektionsmechanismus des Virus bieten viele Möglichkeiten, um spezifische Medikamente oder Impfungen zu entwickeln. Eine Hemmung der Hauptprotease, die Störung der Virus-Zusammensetzung, des Spike-Proteins oder des RTCs sind nur einige von zahlreichen möglichen Angriffspunkten der Wissenschaft, um antivirale Methoden zu entwickeln und eine Ausbreitung zu verlangsamen oder zu stoppen. Bis zum jetzigen Zeitpunkt konnte jedoch noch kein Wirkstoff entwickelt werden, der in klinischen Studien zum gewünschten Ergebnis führt.

Zum Nachlesen (auf Englisch):

Form folgt Funktion

Proteine sind große Moleküle, die aus 400 bis 20.000 Atomen bestehen können. Sie sind die Arbeitstiere der lebendigen Welt – Proteine verarbeiten Nahrung, bauen Muskeln, organisieren Zellteilung und Zellunterteilung und sie bilden Haut und Haare. Ihre Grundbausteine sind Aminosäuren, die eine lange Kette bilden. Diese Kette wird durch komplexe Faltung und Verknüpfung zum funktionellen Molekül. Die Sequenz der Aminosäuren - von denen es 20 verschiedene gibt – entscheidet hierbei über die Faltung des fertigen Moleküls, die man nicht immer vorhersagen kann. Aufgrund der (noch) zu hohen Komplexität müssen die Formen der Moleküle experimentell ermittelt werden.

Modell und Elektronendichte von Penicillin
Molekulares Modell von Penicillin mit Elektronendichte von Dorothy Hodgkin, ca. 1945. Bild von https://proteopedia.org/wiki/index.php/Molecular_sculpture

Eine Proteinstruktur verstehen heißt, zu verstehen wie sie funktioniert und was sie tut. Das Coronavirus trägt den genetischen Code für seine eigenen Proteine in sich, welche dann von der infizierten Wirtszelle produziert werden. Diese Proteine interagieren mit den eigentlichen menschlichen Proteinen. Es ist also wichtig, dass wir diese Proteine verstehen: Die Beeinflussung viraler Proteine oder die Beeinflussung der Interaktion mit der Wirtszelle kann eine Infektion stoppen und uns einen entscheidenden Vorteil im Kampf gegen den unsichtbaren Feind verschaffen - denn er ist jetzt sichtbar.

Aber wie misst und visualisiert man überhaupt etwas so Kleines wie ein Molekül, selbst ein großes? Gute Frage!
Nach der schwierigen Aufgabe, einen Kristall aus so einem großen (und irgendwie labberigem) Molekül zu formen, es wie ein(e) Irre(r) mit Röntgenstrahlen zu beschießen und die Streuung zu messen, werden die Daten mit einem Modell der Struktur interpretiert.

Datenstatistik der PDB
Wachstum der Komplexität und Anzahl makromolekularer Strukturen in der PDB (Proteindatenbank; Bild von RCSB PDB: http://www.pdb.org/pdb/home)

Aber auch mit einem Modell ist es oft kaum möglich, irgendetwas zu erkennen. Es gibt zu viele Atome. Das stete Wachstum der bekannten Strukturen erfordert eine bessere Darstellung zur Analyse und zum Vergleich. Einen großen Teil zur Lösung dieses Problems konnte Jane Richardson von der Duke Universität beitragen, als sie 1980 das Ribbon-Diagramm, oder Bändermodell, entwickelte.

Das Bändermodell

"Ich kann nicht sehen, wie man eine Proteinstruktur mit 1000 Wörtern beschreiben könnte, aber mit einem Bild kann man der Sache ziemlich nahekommen."

- Jane Richardson

Das Bändermodell, eine dreidimensionale, schematische Darstellung, ist heutzutage die meistgenutzte Darstellungsform makromolekularer Strukturen. Das „Band“ zeigt das Rückgrat (= Aminosäurekette) des Proteins. Abhängig von Faltung, die durch sogenannte Wasserstoffbrückenbindungen erreicht wird, kann die Aminosäurekette in drei Kategorien, die Sekundärstrukturen, unterteilt werden: α-Helices, β-Faltblätter und Schleifen.
Diese werden dann als Band-Helices oder Pfeile dargestellt. Wenn es sich um um parallele Pfeile handelt, zeigen beide in die gleiche Richtung. Bei anti-parallelen, zeigen sie in die entgegengesetzte Richtung.
Schleifen werden als einfacher Schlauch, mit geringerem Durchmesser als Helices oder Faltblätter gezeigt. Diverse Merkmale können noch zusätzlich zum Bild hinzugefügt werden.

alpha-Helix-Darstellungen
Verschiedene Darstellungen einer alpha-Helix: Die Hauptkette als Stabmodell, nur die Hauptkette und als Bändermodell. Bild von Ferdinand Kirsten.
Verschiedene Darstellungen eines Faltblattes
Verschiedene Darstellungen eines anti-parallelen beta-Faltblatts mit einer Schlaufe. Die Hauptkette als Stabmodell, nur die Hauptkette und als Bändermodell. Bild von Ferdinand Kirsten.

Strukturen mithilfe von Visualierungsmethoden wie dem Bändermodell zu untersuchen kann einen ausgezeichneten Überblick über die Faltung, Symmetrie und mögliche Interaktions- und Bindestellen im Protein verschaffen. Und strukturelle Eigenschaften bewirken verschiedene Funktionen in Proteinen.
Eine einheitliche Repräsentation der gewonnenen Daten ist der Schlüssel, um diese kleinen, fleißigen Maschinen Stück für Stück besser verstehen und miteinander vergleichen zu können.

ADP-Ribose-Phosphatase aus NSP3, einem SARS CoV-2 Protein als Bändermodell in verschiedenen Ansichten (Proteindatenbank-Eintrag 6vxs). Bild von Ferdinand Kirsten.

Zum aktuellen Problemkind: Das SARS-Coronavirus-2 (oder hCoV2019).
Hier können Bändermodelle viraler Proteine zahlreiche Einblicke in virale Strukturen, ihre Funktion und ihre Rolle bei den Infektionen von Wirtszellen ermöglichen.
Es ist eine Kunst für sich, ein atomares Modell anhand von experimentellen Daten zu bauen. Diese Kunst und die Ideen von Jane Richardson und die anderer Strukturbiologinnen und -biologen beeinflussen tagtäglich das Denken von jungen Wissenschaftlern und unsere Sicht auf das Leben im molekularen Maßstab.

Mehr Informationen:

https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/bmb.2002.494030010005

https://research.duke.edu/ribbon-diagrams

https://blogs.sciencemag.org/pipeline/archives/2018/11/05/hail-to-the-ribbon

https://stories.duke.edu/sciences-mother-of-ribbon-diagrams-celebrates-50-years-at-duke

Logo Coronavirus Structural Taskforce
Top